金门高粱酒酿造副产物黄水的抗酪氨酸酶性质

陈志敏,崔 沂,张维友,胡泳华,王 勤,陈清西(厦门大学生命科学学院,滨海湿地生态系统教育部重点实验室,福建厦门361102)



金门高粱酒酿造副产物黄水的抗酪氨酸酶性质

陈志敏,崔 沂,张维友,胡泳华,王 勤,陈清西*
(厦门大学生命科学学院,滨海湿地生态系统教育部重点实验室,福建厦门361102)

摘要:在金门高粱酒的酿造过程中,采用金选、两糯、兴湘、红梗和红糯5种高粱作为原料,收集得到副产物黄水,分析其成分.研究了5种黄水对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制作用,其导致酶活力下降一半的抑制剂质量浓度分别为130,178, 104,301,230 ng/m L.5种黄水对蘑菇酪氨酸酶二酚酶均表现为可逆的抑制作用,其中金选、红梗、红糯的黄水表现为混合性抑制,两糯和兴湘的黄水表现为非竞争性抑制.探讨了5种黄水对小鼠黑色素瘤细胞B16的细胞增殖率、酪氨酸酶活力和黑色素含量变化的影响.结果表明,100 mg/m L两糯和兴湘的黄水对酪氨酸酶活力的抑制效果较好,抑制率分别为52.7%和40.9%,黑色素含量的抑制率分别为44.5%和46.1%.综上所述,黄水不仅对酪氨酸酶活力有很好的抑制作用,还可以很好地抑制黑色素生成,具有很好的应用前景.

关键词:黄水;成分分析;酪氨酸酶;B16细胞

酒醅在发酵过程中,淀粉由糖变酒的同时产生CO2,单位酒醅的重量相对减少,结晶水游离出来,原料中的单宁、色素、可溶性淀粉、酵母自溶物、还原糖等溶于水中,并沉积于窖池底部而形成黄水[1-2].而黄水中含有丰富的有机酸、酒精,还有糖类和微生物菌体及活细胞等,黄水中的许多物质对提高白酒质量,增加白酒香气,改善白酒风味有着重要的作用.

近年来,关于对黄水资源的再利用开展了大量研究,主要包括利用黄水酿醋[3],制备乙酸乙酯[4],以及利用黄水中的乳酸制备乳酸钙、合成复合有机酸钙[5]等.徐传鸿等[6]对黄水进行常规的成分分析发现其中含有0.13%～ 0.23%的单宁,而Chai等[7]报道单宁物质具有抗酪氨酸酶的作用.我们对金门高粱酒酿造副产物黄水的成分进行了分析,同时探讨了其对酪氨酸酶活力的抑制作用及对小鼠黑色素瘤细胞B16产生黑色素的影响.

1 材料与方法

1.1材 料

黄水收集自金门高粱酒酿造过程中产生的副产物;蘑菇酪氨酸酶(tyrosinase)、L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)均购自Sigma公司;其他试剂为国产分析纯试剂;使用的蒸馏水为去离子重蒸水.

1.2方 法

1.2.1样品制备

收集新鲜酿造黄水,25℃培养24 h;将可发酵物分解后,待酒精度不再增加,真空抽取以去除酒精; 0.45μm膜过滤后,真空浓缩,冷冻干燥待用.

1.2.2黄水的成分分析

淀粉及还原糖测定采用斐林试剂[8],蛋白质以总氮分析仪测定,总固形物采用质量测定法.用二甲基甲酰胺溶液振荡提取单宁,过滤后取滤液,在氨存在的条件下,与柠檬酸铁铵形成棕色络合物,用分光光度计在525 nm处测定其吸光度值,与标准系列比较定量[9].取黄水200 m L,经蒸馏后,取100 m L以酒精计测定酒精.

1.2.3黄水对蘑菇酪氨酸酶活力的影响

参考文献[10]方法,在磷酸盐缓冲液(PBS,p H 6.8)中,以L-DOPA为底物测定酪氨酸酶二酚酶的活book=199,ebook=56力.先加入0.1 m L不同浓度的黄水于比色杯中,再加入2.8 m L预先30℃恒温水浴的底物溶液(含PBS和L-DOPA),然后加入0.1 m L酪氨酸酶水溶液,即刻混匀;在30℃恒温条件下检测波长475 nm下的吸光度值(OD(475))随时间的增长曲线,从曲线斜率计算出酶的活力,产物的消光系数以3 700 L/(mol·cm)计算.通过Lineweaver-Burk双倒数作图,比较酶催化反应的动力学参数,包括表观米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm)的变化,判断抑制作用机理.

1.2.4黄水对小鼠黑色素瘤细胞B16的影响

参照文献[11]的方法,采用RPMI1640培养基, 在37℃的CO2孵箱培养细胞.待细胞生长至近融合状态,经胰蛋白酶消化收集并调整细胞浓度;在96孔细胞培养板中加入小鼠B16黑素瘤细胞的单细胞悬液,每孔180μL,培养过夜;待细胞完全贴壁后,加入20μL含黄水的培养液,继续培养72 h,于结束前4 h弃培养液,用p H 7.4的PBS洗涤,加入10μL噻唑蓝(MTT)和90μL RPMI1640培养液;在37℃的CO2孵箱培养细胞4 h后,弃上清液,加入200μL二甲亚砜(DMSO),在37℃条件下震荡,使甲替结晶完全溶解,立即于酶标仪测定570 nm下的吸光度值(OD570),计算出细胞增殖率.

按上述相同的条件培养细胞,72 h后弃培养液, 用PBS洗涤,加入含1%(体积分数)Triton X-100的PBS 90μL;然后加入10μL 1.0 mg/m L L-DOPA,置于30℃反应30 min,测定OD475.相对酪氨酸酶剩余活力为:OD475/OD570×100%.

待细胞生长至近融合状态,经胰蛋白酶消化收集并调整细胞浓度,接种过夜;待贴壁后换液,加入新鲜培养液和含不同浓度效应物的培养液,继续培养72 h后弃培养液,用PBS洗涤;加入DMSO的NaOH溶液,80℃反应2 h,12 000 r/min离心10 min,上清液分别用于蛋白质浓度测定和405 nm处吸光度值(OD405)的测定,计算出黑色素含量.相对黑色素含量为:OD405/OD570×100%.

2 结 果

2.1黄水的常规成分分析

测定5种高粱在酿酒过程中产生的副产物黄水(YW1～YW5)的成分,包括p H值以及淀粉、蛋白质、总固形物、总氮、单宁、色素、还原糖、总糖和酒精的含量(质量浓度或质量分数),结果列于表1.从表中可见,5种黄水均呈酸性,在淀粉、蛋白质、总氮、还原糖含量方面差异不大,而单宁及色素含量有较大差异.

2.2黄水对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的影响

以L-DOPA为底物,测定5种黄水对酪氨酸酶二酚酶活力的影响.酪氨酸酶二酚酶的反应进程曲线斜率随效应物的质量浓度(ρI)增大而下降,说明5种黄水均对二酚酶活力有抑制作用.由此得到5种黄水抑制酪氨酸酶二酚酶活力的浓度效应曲线(图1),可得YW1～YW5导致酶活力下降一半的浓度(半抑制浓度,IC50)分别为130,178,104,301,230 ng/m L.

图1　5种黄水对酪氨酸酶二酚酶活力的影响Fig.1 Effect of five types of yellow water on the diphenolase activity of tyrosinase

表1　5种高粱产生的黄水(YW1～YW5)的成分分析Tab.1 The component analyses of YW1-YW5

2.3黄水对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的抑制作用测定

固定底物L-DOPA浓度(ρS),改变反应体系中的酶量(质量浓度,ρE),测得的酶活力对酶量作图,得到一组通过原点的直线(图2).由图可见随着金选黄水(YW1)质量浓度的增大,直线斜率降低,说明YW1对酶的抑制作用属于可逆过程,它是通过降低酶的催化效率导致酶活力的下降,而不是通过减少有效的酶量引起酶活力的下降.经测定,其他4种黄水对酪氨酸酶的抑制作用均属于可逆抑制.

2.4黄水对蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的抑制作用类型

以Lineweaver-Burk双倒数作图法来判断不同黄水对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用类型,结果如图3所示.图3(a)为YW1的Lineweaver-Burk双倒数图,得到相交在第三象限的一组直线,由此说明随着YW1质量浓度的增大,Km值和Vm值均变小,其抑制机理表现为混合Ⅱ型.以不同质量浓度YW1下测定的双倒数图直线的截距和斜率分别对YW1质量浓度作图各为一条直线(图3(a)插图Ⅰ和Ⅱ),从直线的斜率可以求得抑制常数KI为196 ng/m L,酶-底物络合物抑制常数KIS为89 ng/m L;同理可得其他4种黄水的Lineweaver-Burk双倒数图(图3(b)～(e)),判断得相应的抑制类型并计算得抑制常数(表2).

图2　不同质量浓度金选黄水(YW1)对酪氨酸酶活力的影响Fig.2 Effect of different concentrations of YW1 on the activity of tyrosinase

图3　5种黄水对酪氨酸酶的抑制类型分析Fig.3 Inhibition type analyses of five types of yellow water on tyrosinase

2.5黄水对小鼠黑色素瘤细胞B16的细胞学效应

以5种黄水为效应物,蒸馏水为阴性对照,分别研究其对小鼠黑色素瘤细胞B16作用72 h后,细胞增殖率、细胞中的酪氨酸酶活力和黑色素含量的变化,结果如图4所示.当YW1质量浓度达到100 mg/m L时,酪氨酸酶剩余活力为49.5%;同时,黑色素含量也随着YW1的增加而减少,抑制率为30.2%.随着YW2和YW3的质量浓度增加,酪氨酸酶活力和黑色素含量均明显降低;当YW2质量浓度达到100 mg/m L时,细胞增殖率、酪氨酸酶剩余活力和黑色素含量分别为15.7%,52.7%和44.5%.当YW3质量浓度达到100 mg/mL时,细胞增殖率、酪氨酸酶剩余活力和黑色素含量分别为17.1%,40.9%和46.1%.当YW4质量浓度大于25 mg/mL时,其对酪氨酸酶活力和黑色素含量有一定程度的抑制,但在测定的质量浓度范围内抑制率不超过30%.当YW5质量浓度仅为1 mg/m L 时,酪氨酸酶活力就已被抑制了12.9%,但随着YW5质量浓度增大,酪氨酸酶活力在测定的质量浓度范围内抑制率不超过20.1%;而当YW5质量浓度达到100 mg/m L时,其对黑色素含量影响不大.

表2　5种黄水对酪氨酸酶的抑制效应Tab.2 Inhibitory effects of five types of yellow water on the activity of tyrosinase

3 讨 论

上述研究结果表明酿酒的副产物黄水具有很好的抑制酪氨酸酶活力的作用,不同品种高粱产生的黄水对酪氨酸酶的抑制效果不同,这可能是由于其成分存在一定差异所致.由于黄水中含有单宁,我们推测其对酪氨酸酶的抑制作用随着单宁含量的不同而不同.5种高粱酿酒的副产物黄水按单宁的含量高低依次为YW1>YW3>YW2>YW5>YW4,而对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的半抑制浓度由高到低依次为YW3>YW1 >YW2>YW5>YW4,两者排序基本一致.Chai等从凤凰木的叶、果实和树皮中提取单宁,探讨其对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用,半抑制浓度分别为38,73和54 μg/m L[12];而在我们研究结果中,黄水对酪氨酸酶的半抑制浓度分别为130,178,104,301和230 ng/m L.由此我们推测黄水中对酪氨酸酶起抑制作用的不仅仅是单宁.黄水是由曲霉发酵酿酒时产生的副产物,曲霉发酵时会产生曲酸,Choi等研究发现曲酸的衍生物对酪氨酸酶具有很好的抑制作用[13],所以我们推测黄水对酪氨酸酶的抑制作用是其中单宁与曲酸共同作用的结果,这有待于进一步研究探讨.

图4　5种黄水对小鼠B16细胞增殖率、细胞中的酪氨酸酶活力和黑色素含量的影响Fig.4 The effects of five types of yellow water on cell vability,activity of tyrosinase and content of melanin in mouse B16 cells

参考文献:

[1] 谭光迅,李净.黄水的组分分析及应用研究进展[J].酿酒科技,2010(10):90-92.

[2] 刘琼,张跃廷.酿酒副产物黄水的综合利用[J].酿酒, 2001,28(4):39-41.

[3] 王敏.黄水酿醋工艺的研究[J].江苏调味副食品,2009,26 (2):31-32.

[4] 马荣山,李婧.化学酯化法对酒尾和黄水的利用[J].中国酿造,2011(12):155-160.

[5] 王国春,陈林,赵东.利用超临界CO2萃取技术从酿酒副产物中提取酒用呈香呈味物质的研究[J].酿酒科技, 2008(1):38-41.

[6] 徐传鸿,余有贵,张文武.黄水的理化分析及其应用研究进展[J].食品安全质量检测学报,2014,5(12): 4011-4017.

[7] CHAI W M,CHEN C M,GAOY S,et al.Structural analysis of proanthocyanidins isolated from fruit stone of Chinese hawthorn with potent antityrosinase and antioxidant activity[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62:123-129.

[8] 程玉倩.沙棘酒发酵过程中主要成分变化的分析[J].酿酒,2008,35(1):78-80.

[9] 穆志新,田翔,师颖.高粱中单宁含量的检测方法分析[J].山西农业科学,2014,42(6):551-553.

[10] CHEN X X,SHI Y,CHAI W M,et al.Condensed tannins from Ficus virens as tyrosinase inhibitors:structure,inhibitory activity and molecular mechanism[J]. PLoS One,2014,9(3):e91809.

[11] CHEN L H,HU Y H,SONG W,et al.Synthesis and antityrosinase mechanism of benzaldehyde thiosemicarbazones:novel tyrosinase inhibitors[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60:1542-1547.

[12] CHAI W M,SHI Y,FENG H L,et al.NMR,HPLCESI-MS,and MALDI-TOF MS analysis of condensed tannins from Delonix regia(Bojer ex Hook.)Raf.and their bioactivities[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60:5013-5022.

[13] CHOI Y J,RHO H S,BAEK H S,et al.Synthesis and biological evaluation of kojic acid derivatives as tyrosinase inhibitors [J].Bulletin of the Korean Chemical Society,2014,35(12):3647-3650.

Antityrosinase Properties of Yellow Water Byproduct of Kinmen Kaoliang Making

CHEN Chihmin,CUI Yi,ZHANG Weiyou,HU Yonghua,WANG Qin,CHEN Qingxi*
(Key Laboratory of the Coastal and Wetland Ecosystems,Ministry of Education, School of Life Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China)

Abstract:The Kinmen Kaoliang was brewed using five species of sorghums,Jinxuan,Liangnuo,Xingxiang,Honggeng and Hongnuo.The byproduct during brewing,the yellow water,was collected,and its inhibitory effect on mushroom tyrosinase was investigated.The results showed that the IC(50)values of five types of yellow water were 130,178,104,301 and 230 ng/m L,respectively, and their inhibition kinetics was reversible,in which the yellow water of Jinxuan,Honggen and Hongnuo displayed a mixed type reversible mechanism,while the one of Liangnuo and Xingxiang displayed an uncompetitive reversible mechanism.Meanwhile,the cell proliferation rate,tyrosinase activity and melanin concentration of mouse B16 melanoma cells were also investigated with five types of yellow water.The data showed that the five types of yellow water had no effect on proliferation of B16 cells.However,the yellow water of Liangnuo and Xingxiang could inhibit the tyrosinase activity of B16 cell at a rate of 52.7%and 40.9%respectively,and could also inhibit the melanin concentration of B16 cells at rates of 44.5%and 46.1%respectively.In all,this study demonstrated that the yellow water not only inhibited the tyrosinase activity,but also inhibited the production of melanin in the B16 cells,implying its potential applications in the cosmetic industry.

Key words:yellow water;component analysis;tyrosinase;B16 cell

*通信作者:chenqx@xmu.edu.cn

基金项目:国家自然科学基金(31271952)

收稿日期:2015-03-14 录用日期:2015-04-29

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.2016.02.009

中图分类号:Q 356.1

文献标志码:A

文章编号:0438-0479(2016)02-0198-05

引文格式:陈志敏,崔沂,张维友,等.金门高粱酒酿造副产物黄水的抗酪氨酸酶性质[J].厦门大学学报(自然科学版),2016,55 (2):198-202.

Citation:CHEN C M,CUI Y,ZHANG W Y,et al.Antityrosinase properties of yellow water byproduct of Kinmen Kaoliang making[J].Journal of Xiamen University(Natural Science),2016,55(2):198-202.(in Chinese)