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P2RX7基因多态性与中国汉族男性原发性痛风的相关性

2016-04-11黄海燕龚琼瑶

关键词:等位基因痛风多态性

陈 勇,应 颖,李 蓁,黄海燕,龚琼瑶

(宁波市第二医院风湿免疫科,浙江宁波 315010)

ChinJAllergyClinImmunol,2016,10(4):340- 345

原发性痛风是指尿酸盐结晶沉积在关节和结缔组织而引起的炎症反应,高尿酸血症是其危险因素[1]。流行病学研究报道,在很多国家原发性痛风和高尿酸血症的患病率逐年增加[2]。荟萃分析数据显示,2000年至2014年中国大陆高尿酸血症的患病率约为13.3%,痛风为1.1%[3]。

目前,越来越多原发性痛风发病机制研究主要集中在固有免疫上。Toll样受体介导的NF-κB途径和NALP3[NACHT,富含亮氨酸重复单位(leucine-rich repeat,LRR)和PYD(pyrin-domain)结构域的蛋白3]炎性体通过产生和激活成熟的白细胞介素1(interleukin- 1,IL- 1),从而导致急性痛风发作[4]。P2X7受体(P2X配体门控离子通道7受体,P2X7R)也称为腺苷三磷酸受体,已被证实为急性痛风发作的一个关键因素[5]。近几年,全基因组关联研究报道了单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)和原发性痛风之间存在关联[6]。文献报道P2RX7基因多态性(rs2230911、rs208294、rs435309和rs28360447)可能影响IL- 1β分泌,从而在原发性痛风发病机制中起着重要的作用[7]。本研究目的是探讨中国汉族男性人群中P2RX7基因多态性(rs2230911、rs208294、rs435309和rs28360447)与原发性痛风发病的相关性。

对象和方法

研究对象

原发性痛风组:219例原发性痛风患者来自2014年10月至2016年3月就诊于宁波市第二医院的门诊及住院患者,均为中国汉族男性,平均年龄(50±14.85)岁,所选人群之间均无血缘关系。原发性痛风诊断符合1977年美国风湿病协会制订的标准[8]。该研究得到宁波大学医学院宁波市第二医院伦理委员会批准,并遵守赫尔辛基宣言的伦理原则。

健康对照组:247例健康对照者来自2014年10月至2016年3月宁波市第二医院的体检者。并排除痛风等风湿性疾病、癌症、高血压、糖尿病、高脂血症、肝病、肾病和血液病史,均为中国汉族男性,平均年龄(44.03±10.75)岁,所选人群之间均无血缘关系,参加者签署知情同意书。

方法

外周血DNA提取:抽取静脉血2 ml,收集入2% EDTA管中。取200 μl全血用QIAamp DNA试剂盒(Qiagen公司,德国希尔登)提取全基因组DNA,并置于-80 ℃冰箱保存。

目的片段扩增:用Primer5.0软件对P2RX7基因的7个单核苷酸多态性(rs2230911、rs208294、rs435309和rs28360447)进行引物设计。并用SNaPshot方法进行基因分型。

基因分型检测:用3730测序仪进行基因分型检测,并用GeneMapper 4.0软件对测序结果进行分析。

统计学处理

结  果

临床资料和生化指标比较

原发性痛风组年龄、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清肌酐、血清尿酸、血糖、血清总胆固醇、血清三酰甘油、白细胞计数明显高于健康对照组,而高密度脂蛋白胆固醇水平明显低于健康对照组(P<0.001)。两组低密度脂蛋白胆固醇水平相比,差异无统计学意义[原发性痛风组:(2.54±0.91)mmol/L;健康对照组:(2.64±0.50)mmol/L,P=0.293](表1)。

基因型和等位基因比较

经Hardy-Weinberg平衡检验,在原发性痛风组和健康对照组中,P2RX7 rs2230911、rs208294和rs435309 3个基因位点处于遗传平衡,具有群体代表性(P>0.05)。在原发性痛风组和健康对照组中,P2RX7 rs2230911基因型频率(CC 63.0%,CG 34.7%,GG 2.3%)和等位基因频率(C 80.4%,G 19.6%)差异有统计学意义(P值分别为0.012和0.013)。 在原发性痛风患者中,G等位基因的频率明显高于对照组[OR(95%CI)=1.56(1.10, 2.21),P=0.013]。将rs2230911进行显性模型CC和CG+GG比较,基因型在原发性痛风组和健康对照组亦存在明显差异[OR(95%CI)=1.79(1.20, 2.67),P=0.005]。而P2RX7 rs208294和rs435309基因型或等位基因频率在原发性痛风组和健康对照组中差异无统计学意义(P>0.05)。将P2RX7 rs208294和rs435309分成显性模型TT和TC+CC或隐性模型TT+TC和CC,基因型频率在两组中差异无统计学意义(P>0.05)(表2、3)。

表1 原发性痛风组与健康对照组临床资料和生化指标Table 1 Clinical data and biochemical indexes of primary gout patients and

ALT:谷丙转氨酶; AST:谷草转氨酸; CREA:肌酐; UA:尿酸; GLU:血糖; TC:总胆固醇; HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇; LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇; TG:三酰甘油; CRP:C反应蛋白; WBC:白细胞计数

表2 原发性痛风组与健康对照组rs2230911,rs208294,rs435309和rs28360447基因型和等位基因频率Table 2 Genotype and allele frequencies of rs2230911,rs208294,rs435309 and rs28360447 in primary gout patients and controls

HEW:Hardy-Weinberg平衡检验

原发性痛风组P2RX7rs2230911基因型之间与临床生化资料比较

将P2RX7 rs2230911的基因型分为CC、CG和GG三组。在原发性痛风组中,CC、CG和GG三组间血糖水平差异有统计学意义(P=0.047);显性模型中CC和CG+GG两组间血糖和高密度脂蛋白胆固醇水平差异有统计学意义(P值分别为0.032和0.049)。其他变量在各组中差异无统计学意义(P>0.05)(表4)。

讨  论

P2X7受体是一个由595个氨基酸组成的蛋白质,是配体门控通道家族中的一员[9- 10]。P2RX7基因在单核细胞和固有免疫中发挥着重要作用,主要包括Toll样受体介导的NF-κB途径和NALP3炎性体途径[11- 12]。当细胞外的ATP浓度发生急剧的变化时,P2X7受体被激活并开放,导致K+外流和Na+和Ca2+内流,从而进一步导致细胞因子如IL- 1的释放和活化[13- 16]。 IL- 1β是IL- 1的活性形式,在导致原发性痛风的急性发作中充当着重要的角色[17- 18]。有研究发现,P2RX7基因与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、慢性淋巴细胞性白血病硬化、多发性硬化、结核病和克罗恩病等相关[19- 23]。

P2RX7基因具有高多态性,其中位点包括rs2230911、rs208294、rs435309和rs28360447等。rs2230911(T357S

表3 原发性痛风组与健康对照组rs2230911,rs208294和rs435309基因型频率Table 3 Allele frequencies of rs2230911,rs208294, and rs435309 in primary gout patients and controls

表4原发性痛风组rs2230911基因型的生化指标比较
Table4Comparation of biochemical indexes in primary gout patients with genotype of rs2230911

分组年龄(岁)ALT(IU/L)AST(IU/L)CREA(μmol/L)UA(μmol/L)GLU(mmol/L)CC50.09±14.9639.10±37.8427.28±13.6283.59±19.01432.76±150.905.50±1.57CG52.78±14.9835.07±23.1728.17±15.0582.51±17.01411.74±138.646.35±1.92GG46.00±5.6639.80±23.2725.80±12.1573.72±8.53521.40±156.884.86±1.11P1值0.3390.4840.8790.4780.2260.047P2值0.2760.4450.7220.530.5290.032P3值0.1190.8890.7790.250.150.603分组TC(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)TG(mmol/L)CRP(mg/L)WBC(×109/L)CC4.99±1.051.28±0.302.54±0.882.50±1.5311.01±21.028.33±3.01CG4.77±1.261.15±0.332.52±1.012.31±1.389.57±17.237.98±3.10GG5.02±0.671.18±0.272.82±0.422.25±0.815.10±5.5211.08±5.07P1值0.6360.1440.9060.820.7490.094P2值0.3670.0490.990.5290.6970.76P3值0.9040.7880.6610.8560.6990.275

P1:CC、CG和GG间比较;P2:CC与CG+GG比较;P3:CC+CG与GG比较; ALT:谷丙转氨酶; AST:谷草转氨酸; CREA:肌酐; UA:尿酸; GLU:血糖; TC:总胆固醇; HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇; LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇; TG:三酰甘油; CRP:C反应蛋白; WBC:白细胞计数

或1096C→G)是指在P2RX7基因的第1096个位点上,碱基胞嘧啶(C)突变为鸟嘧啶(G),从而导致苏氨酸突变成色氨酸[24- 25]。该位点多态性不仅与原发性痛风相关,与其他免疫疾病也存在着密切的联系。2013年的一篇实验性文章报道了rs2230911与系统性红斑狼疮性肾病有着密切的关系,而等位基因rs2230911-G为保护因素[26]。在HapMap数据库中,中国人群rs2230911-G的等位基因频率为24.4%,而在本研究中,rs2230911-G的等位基因频率为13.6%,两者差异无统计学意义。等位基因C是原始碱基;而等位基因G是突变碱基,是发生原发性痛风的危险因素。突变纯合型GG和突变杂合型CG患者与野生型CC患者相比,更易发生原发性痛风。此外,突变纯合型GG和突变杂合型CG患者更易发生高血糖和低高密度脂蛋白胆固醇,并可能进展为糖尿病和代谢综合征。本研究结果提示可以对P2RX7 rs2230911基因型为GG和GC的患者进行早期干预,以避免患者发展为原发性痛风、糖尿病等。

P2RX7 rs208294(His155Tyr,H155Y或489T→G)是指组氨酸突变成酪氨酸,此突变改变了P2X7受体胞外的结构域,并影响了受体单元结构的组装。Giulio等[27]研究发现,rs208294的多态性能增强慢性淋巴细胞白血病患者P2X7受体的功能。之后的研究还发现,rs208294多态性在风湿性关节炎患者中亦可以增强P2X7受体的功能[28]。等位基因C的频率在HapMap数据库和在本研究中分别为30.5%和39.5%。P2RX7 rs435309(亦称为rs1752809,Val76Ala,253T→C)的突变导致了P2X7受体功能的高度损伤[29]。在本研究的健康对照组中,等位碱基C频率为46.4%。但在HapMap数据库中没有该项数据的报道。

P2RX7 rs28360447多态性不符合Hardy-Weinberg平衡,这意味着所选样本未能代表整个群体样本,因此本实验未进行下一步的基因型和等位基因频率的分析。Sebastien等[29]的实验证实了P2RX7 rs28360447(Gly150Arg,G150R或474G→A)多态性会导致受体功能的完全丧失。在Daniel的一项在混合人群中的实验发现,等位基因A频率约为1.3%,然而在我们的研究中,该等位基因的频率为0。

本研究存在一定的局限性。首先,样本量不足导致P2RX7 rs28360447多态性未能符合Hardy-Weinberg平衡,从而无法进行该位点的统计学处理。第二,所有病例组和健康对照样本都来自同一家医院,因此可能存在选择偏倚。第三,本研究只涉及中国汉族男性,其结果不能代表女性及其他种族人群。此外,P2RX7基因有其他多态性位点,如rs7958311、rs7958316、rs2230912、rs1653624和rs35933842等,可能也与原发性痛风的发病风险相关。

综上所述,本研究认为P2RX7 rs2230911多态性在中国汉族男性人群中,可能与原发性痛风的发病风险相关,其中等位基因G可能是原发性痛风的危险因素。

[1]张冰清, 盛峰, 谷俊杰,等.《2015 年美国风湿病学会/欧洲抗风湿联盟痛风分类标准》摘译[J]. 中华临床免疫和变态反应杂志,2015,9: 333- 336.

[2]Roddy E, Zhang W, Doherty M. The changing epidemiology of gout[J]. Nat Clin Pract Rheumatol, 2007, 3:443- 449.

[3]Liu R, Han C, Wu D, et al. Prevalence of hyperuricemia and gout in mainland china from 2000 to 2014: a systematic review and meta-analysis[J]. Bil Med Research International, 2015, 10: 1155.

[4]Tao JH, Zhang Y, Li XP. P2X7R: a potential key regulator of acute gouty arthritis[J]. Semin Arthritis Rheum, 2013, 43: 376- 380.

[5]Ferrari D, Pizzirani C, Adinolfi E, et al. The P2X7 receptor: a key player in IL- 1 processing and release[J]. J Immunol, 2006, 176: 3877- 3883.

[6]Choi HK, Zhu Y, Mount DB. Genetics of gout[J]. Curr Opin Rheumatol, 2010, 22: 144- 151.

[7]Gong QY, Chen Y. Correlation between P2X7 receptor gene polymorphisms and gout[J]. Rheumatol In, 2015, 35: 1307- 1310.

[8]Zhang W, Doherty M, Pascual E, et al. EULAR evidence based recommendations for gout. Part I: Diagnosis. Report of a task force of the Standing Committee for International Clinical Studies Including Therapeutics(ESCISIT)[J]. Ann Rheum Dis, 2006, 65: 1301- 1311.

[9]Surprenant AF, Rassendren E, Kawashima RA, et al. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor(P2X7)[J]. Science,1996, 272: 735- 738.

[10] North RA. Molecular physiology of P2X receptor[J]. Physiol Rev, 2002, 82: 1013- 1067.

[11] Buell GN, Talabot F, Gos A, et al. Gene structure and chromaosomal localization of the human P2X7 receptor[J]. Receptors Channels, 1998, 5: 347- 354.

[12] Di VF, Chiozzi P, Ferrari D, et al. Nucleotide receptors: an emerging family of regulatory molecules in blood cells[J]. Blood, 2001, 97: 587- 600.

[13] Virginio CA, Mackenzie RA, North RA, et al. Kinetics of cell lysis, dye uptake and permeability changes in cells expressing the rat P2X7 receptor[J]. J Physiol, 1999, 519: 335- 346.

[14] Eleftheriadis T, Pissas G, Karioti A, et al. Uric acid induces caspase- 1 activation, IL- 1β secretion and P2X7 receptor dependent proliferation in primary human lymphocytes[J]. Hippokratia, 2013, 17: 141- 145.

[15] Alves LA, Bezerra RJ, Faria RX, et al. Physiological roles and potential therapeutic applications of the P2X7 receptor in inflammation and pain[J]. Molecules, 2013, 18: 10953- 10972.

[16] Safina G, Aleta P, Vanessa S, et al. P2X7 receptor activation mediates organic cation uptake into human myeloid leukaemic KG- 1 cells[J]. Purinergic Signal, 2012, 8: 669- 676.

[17] Terkeltaub RA, Schumacher HR, Carter JD, et al. Rilonacept in the treatment of acute gouty arthritis: a randomized, controlled clinical trial using indomethacin as the active comparator[J]. Arthritis Res Ther, 2013, 15: R25.

[18] Schlesinger N, Alten RE, Bardin T, et al. Canakinumab for acute gouty arthritis in patients with limited treatment options: results from two randomized, multicentre, active-controlled, double-blind trials and their initial extensions[J]. Ann Rheum Dis, 2012, 71: 1839- 1848.

[19] Shukaili A, Kaabi J, Hassan B, et al. P2X7 receptor gene polymorphism analysis in rheumatoid arthritis[J]. Int J Immunogenet, 2011, 38: 389- 396.

[20] Oyanguren DO, Rodriguez AA, Villoslada P, et al. Gain-of-function of P2X7 receptor gene variants in multiple sclerosis[J]. Cell Calcium, 2011, 50: 468- 472.

[21] Thunberg U, Tobin G, Johnson A, et al. Polymorphism in the P2X7 receptor gene and survival in chronic lymphocytic leukaemia[J]. Lancet, 2002, 360: 1935- 1939.

[22] The Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome wide association study of 14,000 cases if seven common diseases and 3,000 shared controls[J]. Nature, 2007, 447: 661- 678.

[23] Nath SK, Quintero-Del-Rio AI, Kilpatrick J, et al. Linkage at 12q24 with systemic lupus erythematosus(SLE) is established and confirmed in Hispanic and European American families[J]. Am J Hum Genet, 2004, 74: 73- 82.

[24] Sun CQ, Jessica C, Sarita S, et al. Identification and characterization of a novel variant of the human P2X7 receptor resulting in gain of function[J]. Purinergic Signal, 2010, 6: 31- 45.

[25] Anne NS, Ronald S, Suran LF, et al. A Thr357 to Ser polymorphism in homozygous and compound heterozygous subjects causes absent or reduced P2X7 function and impairs ATP-induced mycobacterial killing by macrophages[J]. J Biol Chem, 2006, 281: 2079- 2086.

[26] Chen GM, Feng CC, Ye QL, et al. Association of P2X7R gene polymorphisms with systemic lupus erythematosus in a Chinese population[J]. Mutagenesis, 2013, 28: 351- 355.

[27] Giulio C, Simonetta F, Sylvia LF, et al. A His- 155 to Tyr polymorphism confers gain-of-function to the human P2X7 receptor of human leukemic lymphocytes[J]. J Immunol, 2005, 22: 1767.

[28] Liliana PC, Perla NM, Mariana SB, et al. The His155Tyr(489 C>T) single nucleotide polymorphism of P2X7R gene confers an enhanced function of P2X7 receptor in immune cells from patients with rheumatoid arthritis[J]. Cell Immunol, 2012, 276: 168- 175.

[29] Sebastien R, Zhu ZM, Jocelyn MB, et al. Single nucleotide polymorphisms that were identified in affective mood disorders affect ATP-activated P2X7 receptor functions[J]. J Psychiatr Res, 2010, 44: 347- 355.

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