诺丽果汁对H2O2诱导PC12细胞损伤的保护作用

谭琳++郑晓燕++陈娇+++郑学勤+++马蔚红+艾斌凌++王朝政

摘要：为了探讨诺丽果汁对过氧化氢诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用，本试验采用H2O2造成PC12神经细胞氧化损伤模型，通过荧光显微镜观察细胞形态，MTT测定细胞存活率、乳酸脱氢酶（LDH）活力检测法，Ho/PI染色检测细胞凋亡和细胞坏死，研究的诺丽果汁对过氧化氢所致PC12 细胞氧化损伤的影响。结果发现，体积分数在1%～5%诺丽果汁均能不同程度地保护细胞形态，增加细胞的生存率，抑制过氧化氢诱导的PC12细胞坏死，减少损伤后LDH的生成。以上结果表明，1%～5%体积分数诺丽果汁对过氧化氢诱导的PC12细胞损伤有保护作用。

关键词：诺丽果汁；H2O2；PC12细胞；细胞坏死；乳酸脱氢酶

中图分类号： TS275.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0317-03

收稿日期：2015-03-24

基金项目：中国热带农业科学院海口实验站科研启动项目（编号：HKZKY140204）；农业部财政项目“热带野生果树种子资源收集、利用和评价”。

作者简介：谭琳（1974—），女，博士，副研究员，研究方向为食品分子营养。E-mail：tanlin7402@126.com。

通信作者：马蔚红，研究员，主要从事热带作物种质资源收集与评价研究，E-mail：zjwhma@163.com；郑学勤，研究员，主要从事热带作物遗传育种研究。E-mail：zhengxxxqin@126.com。氧化应激是由活性氧自由基和活性氮自由基产生和清除失衡引起的应激损伤状态[1]，在中枢神经系统退行性疾病中起着重要作用[2-3]。近年来，越来越多的研究显示植物多酚具有强抗氧化性，且在防治氧化损伤神经退行性疾病有着重要的作用[4-5]。诺丽（Morinda citrifolia），又称诺尼、海巴戟，属茜草科巴戟天属植物，主要分布在南太平洋诸岛屿以及中国的海南岛、西沙群岛和台湾岛等地[6]。早在2 000多年前，南太平洋岛屿的波利尼西亚人就发现诺丽果实具有天然的健康和医学功效，经常将诺丽果压成汁液，作为日常饮品和用于治疗癌症、糖尿病、高血压等多种疾病[7]。现代医学也表明诺丽具有抗氧化、抗癌、降糖等多种生物学活性[8-10]，但是关于其神经保护方面的功能鲜见报道。前期研究表明诺丽果汁中多酚含量高达1.934 mg/mL，且对DPPH 自由基、ABTS 自由基、羟自由基、过氧化氢等均具有很好的清除活性[11]。本研究利用H2O2诱导类神经细胞系PC12细胞产生氧化损伤模型，检测诺丽果汁对PC12细胞的保护作用，旨在为新型诺丽果汁保健产品的开发奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞PC12高分化细胞（大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株）购于中国学科院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。

1.1.2诺丽果汁诺丽果由郑学勤研究员采自海南陆侨集团三亚种植基地，将采来的新鲜诺丽果实去皮和去籽，果肉用医用纱布包裹，挤压，得到诺丽果汁，果汁再用一次性0.22 μm 滤膜（milipore）进行过滤除菌，备用。

1.1.3药品和试剂RMPI1640培养液购自北京索莱宝公司；无支原体胎牛血清为杭州四季清生物工程材料有限公司产品；Trypsin为 Amersco 公司产品；DMSO、LDH 脱氢酶试剂盒购自Promega公司；MTT、Hoechst33342/PI细胞凋亡测定试剂盒上海美吉生物医药科技有限公司。

1.1.4主要仪器超净工作台（苏净安泰VS-840K-U，苏州），二氧化碳培养箱（Thermo/Forma3111，美国），倒置荧光显微镜（Zeiss/Axiovert 40CFL，德国），全自动酶标仪（Thermo Multiskan FC，美国）；细胞培养瓶，细胞培养板（康宁）。

1.2方法

1.2.1细胞培养PC12细胞培养用含10%胎牛血清 RMPI 1640 培养液，37 ℃、5% CO2条件下培养，每2 d传代1次。待细胞增长至80%融合时，用0.25%胰酶消化细胞，调整细胞密度至1 × 105 个/mL 后传代或接种于细胞培养板进行各项指标测定。

1.2.2细胞形态检测取对数生长期的PC12细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μL。培养24 h后吸弃培养液。试验分为对照组、损伤组、预防组，每组设3个复孔。对照组细胞按常规方法培养，预防组用终体积分数分别为1%、2.5%、5%的诺丽果汁培养24 h后，吸弃培养液，PBS冲洗1～2次，加入H2O2终浓度为0.3 mmol/L的培养液，培养4 h，损伤组用不含诺丽果汁的培养液培养，其余处理方法与预防组细胞相同，荧光倒置显微镜检查细胞形态。

1.2.3MTT检测诺丽果汁对氧化应激损伤PC12 细胞活力的影响按照“1. 2 .2”节进行试验分组、给药处理及培养，然后用MTT法测定细胞活力，向各孔加入5 g/L的MTT后继续培养4 h，小心吸弃所有培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO） 振荡10 min。在酶标仪上以560 nm 波长测定各孔吸光度D。按相对活力=（D处理-D空白）/（D正常平均-D空白） × 100%公式计算细胞相对活力。

1.2.4细胞凋亡和细胞坏死检测根据Hoechst33342/PI试剂盒说明书进行细胞凋亡和细胞坏死检测。先配制好染色缓冲液，然后对各处理组进行离心收集悬浮细胞，用PBS洗涤细胞2次。取适量离心收集好的细胞用0.5～1 mL 染色缓冲液将细胞重悬，使其浓度大约为1 ×106 个/mL。加入5 μL Hoechst 33342染色液。 轻轻混匀后室温避光孵育10～15 min。用PBS洗涤细胞1次，用0.5～1 mL染色缓冲液将细胞重悬，加入5 μ LPI染色液，轻轻混匀后室温避光孵育10～15 min，再用PBS洗涤细胞1次，加PBS稀释至适当浓度后荧光显微镜检测结果。Hoechst33342-DNA的最大激发波长为350 nm，最大发射波长为460 nm，PI的最大激发和最大发射波长分别为488、615 nm。

1.2.5LDH检测诺丽果汁对PC12 细胞的保护作用细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的破坏时，细胞内的LDH会释放到培养基中，而活细胞则不会，所以培养上清中LDH的活性可以反映细胞的死亡或损伤程度。各组细胞经相应处理后，吸取细胞培养上清，按照试剂盒说明书操作检测LDH含量。

1.2.6数据处理与统计分析采用SAS 9.0统计分析软件分析试验数据，处理组之间差异显著性分析采用邓肯氏（Duncans）多重比较法，以P<0.05为差异显著。

2结果

2.1诺丽果汁对PC12细胞形态的影响

本研究发现，对照组细胞呈长梭形或多角形镶嵌状排列，细胞边界清晰，大小均匀，细胞丰满，无重叠生长现象（图1-A）。而H2O2损伤组细胞出现收缩、变圆、体积变小，细胞间隙增宽，大部分细胞破碎、脱落，但细胞轮廓尚较清晰（图1-B）。用不同剂量诺丽果汁预处理后均有不同程度的保护作用，细胞形态好于损伤组（图1），其中10%诺丽果汁预处理组细胞形态与对照组接近（图1-E）。

2.2诺丽果汁对H2O2氧化损伤PC12细胞存活率的影响

不同质量浓度诺丽果汁均可减小H2O2对细胞的增殖抑制作用，细胞存活率从120%增加到166%，与H2O2损伤组比，差异极显著（P<0.01）（图2）。此结果表明，在一定浓度范围内，诺丽果汁不仅有保护细胞免受损伤的作用，而且还有促进细胞增殖的作用。

2.3诺丽果汁对H2O2氧化损伤PC12细胞坏死的影响

Hoechst33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，与DNA结合，凋亡细胞有膜通透性改变，主要摄取Hoechst染料，凋亡细胞中的凝聚染色质会比正常细胞中的染色质染色更深、更加明亮，表现为强蓝色荧光。坏死细胞由于有很强的PI嗜染性并可覆盖Hoechest染色，故呈强红色荧光。本研究发现，对照组有少数 PI染色阳性细胞（橘黄色），300 μmol/L H2O2处理组PI染色阳性细胞显著增加，而经诺丽果汁预处理后PI阳性细胞完全没有，但有少量凋亡细胞（亮蓝色）（图3）。以上结果表明，诺丽果汁可显著地减少H2O2诱导的细胞坏死。

2.4诺丽果汁对H2O2氧化损伤PC12细胞LDH漏出率的影响

研究发现对照组中的LDH含量较低，而模型组中的LDH含量极显著高于对照组。经诺丽果汁保护后，LDH含量下降，并随诺丽果汁浓度的增加而显著降低（（图4）。结果表明，诺丽果汁有效降低H2O2对PC12细胞的氧化损伤，且在1%～5%的浓度范围内其保护效果与诺丽果汁浓度呈正相关。

3结论与讨论

本研究用H2O2造成PC12神经细胞氧化损伤模型，通过荧光显微镜观察细胞形态，MTT测定细胞存活率、乳酸脱氢酶（LDH）活力检测法，Ho/PI染色检测细胞凋亡探讨诺丽果汁对过氧化氢所致PC12细胞氧化损伤的影响，发现1%～5%体积分数诺丽果汁均能不同程度地保护细胞形态，增加细胞的生存率，抑制过氧化氢诱导的PC12细胞坏死，减少损伤后LDH的生成，表明1%～5%体积分数诺丽果汁对过氧化氢诱导的PC12细胞损伤有保护作用，这将为诺丽果用于开发神经保护方面的保健品奠定了理论依据。

自1983年Mosmann创立了MTT比色法以来，由于其经济、灵敏、无放射性污染等特点，使之成为细胞生物学及相关研究领域一种常用的细胞活性检测方法[12]。本研究采用MTT 比色法分析了1%～5%范围内诺丽果汁对过氧化氢诱导PC12损伤存活率的影响，发现其不仅有保护细胞免受损伤的作用，而且还有促进细胞增殖的作用，但有研究显示，10%诺丽果汁能降低Hela细胞（宫颈癌细胞）22.3%的生存率，具有抗癌作用[13]，这表明不同浓度范围的诺丽果汁对细胞的增殖作用不同。

虽然本研究首次报道了1%～5%体积分数诺丽果汁具有神经保护作用，但是在更大浓度的范围内，诺丽果汁对过氧化氢诱导的PC12细胞损伤是否还存在保护作用尚不得而

知。此外，1%～5%体积分数诺丽果汁产生的保护作用机制尚不清楚。因此，今后将在更广的浓度范围内研究诺丽果汁对PC12细胞的保护作用，并探究其作用机制。

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