镉诱导锦鲤肾脏氧化性DNA损伤及谷胱甘肽抗氧化系统改变

刘思思++高旋旋++胡竹青++程超++渠漫漫++孙晴++刘缠民+++郑桂红

摘要：研究镉（Cd）暴露对锦鲤（Carassius auratus L.）肾脏氧化应激、氧化性DNA损伤、谷胱甘肽抗氧化系统的影响。试验采用静水生物养殖法，将40尾锦鲤随机分为4组，每组10尾，分别暴露于0、5、10、20 mg/L的CdCl2水溶液中，持续96 h。观察锦鲤的行为变化，测定肾脏丙二醛（MDA）含量、氧化性DNA指标8-羟基鸟嘌呤（8-OHdG）水平、还原型谷胱甘肽（GSH）水平，并检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCL）的活性。结果表明，Cd暴露使锦鲤发生明显改变，MDA、8-OHdG、GSH水平均升高，并改变了谷胱甘肽抗氧化酶系统。

关键词：锦鲤；镉；肾脏；DNA损伤；氧化应激

中图分类号： S941.91文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0272-02

收稿日期：2015-06-08

基金项目：江苏省自然科学基金（编号：BK20141147）；江苏省徐州市科技计划（编号：XF11C051）；江苏省化学生物学优势学科基金（编号：PAPD）。

作者简介：刘思思（1988—），女，江苏徐州人，硕士研究生，主要从事生态学研究。E-mail：liusisi644@163.com。镉（Cd）是一种毒性很大的重金属，主要作为锌矿、硫化物矿、铅矿、铜矿等的副产物，在矿的开采、冶炼、精炼过程中进入环境，并对环境造成危害。镉一旦进入水中，会对水体生态系统造成严重污染，危害水生生物的生命[1-2]。

锦鲤（Carassius auratus L.）是鲤科（Cyprinidae）鲤属（Carassius）的一种观赏鱼，颜色艳丽，形态优美，同时也是水生环境监测的一种试验鱼种类[3]。氧化应激是重金属对鱼类造成损伤的常见方式，很多重金属都会诱导氧化应激损伤[2-3]。谷胱甘肽抗氧化酶系统由还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCL）组成，在动物机体抗氧化损伤中承担重要作用[4]。研究表明，镉能够引起淡水鲇鱼（Channa punctatus）[2]、广东鲂（Megalobrama terminalis）[5]、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）[6]等鱼的氧化损伤。本研究以锦鲤为试验对象，探讨镉暴露对锦鲤肾脏DNA损伤、谷胱甘肽抗氧化系统的影响，以期为环境监测及镉害防治提供依据。

1材料与方法

1.1材料

供试红白锦鲤购自徐州市佳顺锦鲤养殖基地，体长5～7 cm、质量4～7 g/尾。试验采用静水生物养殖法。试验用水为曝气3 d的自来水，每组20 L，24 h不间断充氧，溶氧量 6 mg/L，pH值6.8，水温（23±1） ℃。先将锦鲤置于室内水族箱进行为期7 d的预试验。锦鲤暂养期间活动正常、无病，死亡率低于5%。于试验前24 h停止饲喂，选择品相较好、健康的红锦鲤40尾，随机分为4组，3个处理组的CdCl2浓度分别为5、10、20 mg/L。试验期间不饲喂、 不换水，每天观察其行为。于96 h后处死，取其肾脏，冰浴生理盐水匀浆，以 3 000 r/min 冷冻离心10 min制备组织上清液，测定其生化指标。

1.2 鱼行为观察

按照Sveceviius的方法[7]将鱼的行为活性分为5级（0、1、2、3、4级）。每天观察记录鱼的行为并对其分级。

1.3氧化应激及谷胱甘肽抗氧化系统指标测定

丙二醛（MDA）水平、还原型谷胱甘肽（GSH）水平、蛋白含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活性、谷胱甘肽还原酶（GR）活性均采用试剂盒（南京市建成生物工程研究所）进行测定，谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）采用苏州市科名生化指标试剂盒测定，所用仪器为UV-722型紫外可见分光光度计。

1.4DNA损伤测定

根据已有研究的方法[8]，采用商品试剂盒（Wako Pure Chemical Industries，Ltd.），按说明书进行操作。采用带有检测器的高效液相色谱（Agilent Technologies，USA）进行测定，8-OHdG 的表示方法为8-OHdG/10-5 deoxyguanosine。

2 结果与分析

2.1镉对鱼行为的影响

观察鱼的行为并测定其行为活性。由图1可知，不同浓度镉暴露对鱼的行为具有不同影响。与对照组相比，中低浓度镉暴露抑制鱼的行为活性，而高浓度镉暴露则呈1 d时抑制、之后强烈激发的现象。以不同时间比较，各处理组均呈 1 d 行为活性不高、2～3 d活性增强、4 d活性下降的趋势，但仍高于对照组。

2.2镉对鱼肾脏的氧化应激及DNA损伤

MDA含量、8-OHdG水平常作为氧化应激的指标，由测定结果（表1）可知，镉暴露导致锦鲤肾脏MDA含量、8-OHdG水平明显升高。与对照组相比，5、10、20 mg/L镉暴露下MDA含量分别增大15.2%、169.4%、398.0%，8-OHdG水平分别增大16.1%、32.3%、64.5%。可见，镉暴露引起了锦鲤肾脏氧化应激损伤及DNA损伤。

2.3镉对锦鲤肾脏谷胱甘肽抗氧化系统的影响

由锦鲤肾脏谷胱甘肽抗氧化系统指标的测定结果（表2）可知，96 h镉暴露使系统活性明显升高。与对照组相比，5、10、20 mg/L镉暴露下GSH含量分别增加8.7%、20.2%、27.0%，GPX活性分别提高10.4%、15.7%、24.2%，GST活性分别提高16.3%、33.1%、57.8%，GR活性分别提高 16.0%、30.3%、46.3%，GCL活性分别提高18.1%、28.2%、32.7%。可见，镉暴露导致锦鲤肾脏谷胱甘肽抗氧化系统发生改变。

3结论与讨论

镉会对水生生态系统造成很大影响。本研究表明，不同体积分数的镉暴露对锦鲤行为活性具有不同影响，呈低抑制、高激发的现象。在5、10 mg/L的镉暴露浓度下，行为活性均明显低于对照；20 mg/L的镉暴露浓度则明显激发行为活性，表明高浓度镉暴露对锦鲤具有明显刺激作用。行为活性随时间的推移呈早期激发、后期抑制的趋势，表明锦鲤刚接触镉刺激时活性变强，疲惫后活动行为变慢。

脂质过氧化产物指机体中脂质被氧化后的产物，是反映氧化应激的重要指标。研究表明，镉能够强烈抑制线粒体电子传递链，导致电子无法正常传递至接受体，而是传递至氧原子，从而产生大量氧自由基，引起机体氧化损伤[2-9]。氧自由基也可通过多种途径造成DNA损伤，如引起单链DNA断裂、DNA与蛋白质交联、构成DNA的基础物质发生改变。8-OHdG是氧自由基诱导鸟嘌呤C-8发生羟基改变的产物，因此8-OHdG常作为氧化性DNA损伤的标志[4]。本试验中，脂质过氧化产物MDA含量、8-OhdG水平均明显升高，表明镉暴露引起了锦鲤肾脏氧化损伤。

谷胱甘肽是一种非酶抗氧化物质，在调节脂质过氧化产物的产生、减少氧化反应发生中起重要作用。已有研究表明，镉暴露能够诱导GSH含量的升高，可能是由于对抗其引起的氧化应激损伤[10]。本试验发现96 h镉暴露同样引起了GSH含量的升高。GR、GCL是维持GSH含量的重要酶，GR能够催化氧化型谷胱甘肽转化为GSH，GCL是GSH生物合成的限速酶。GST是谷胱甘肽结合反应的关键酶，催化该反应的起始步骤。GPx是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GST、GPx、GR、GCL、GSH在机体抗氧化中发挥重要作用。镉暴露引起GSH水平升高，以及GR、GCL、GST、GPX活性上升，提示机体在尽力调动谷胱甘肽抗氧化系统以对抗镉引起的氧化损伤。本试验结果为研究镉引起动物组织损伤的机制提供依据。

参考文献：

[1]陈再忠，沈芾，孔令富，等. 重金属镉在锦鲤各组织中的富集[J]. 江苏农业科学，2011，39（6）：387-389.

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[3]郑桂红，唐玲玲，孙建梅，等. 重金属锌对锦鲤组织氧化损伤的作用[J]. 江苏农业科学，2014，42（3）：187-189.

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[5]曾艳艺，赖子尼，杨婉玲，等. 广东鲂幼鱼对铜、镉胁迫的氧化应激响应及其指示意义[J]. 生态环境学报，2014，23（12）：1972-1979.

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[8]Liu C M，Zheng G H，Ming Q L，et al. Sesamin protects mouse liver against nickel-induced oxidative DNA damage and apoptosis by the PI3K-Akt pathway[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61（5）：1146-1154.

[9]Stohs S J，Bagchi D，Hassoun E，et al. Oxidative mechanisms in the toxicity of chromium and cadmium ions[J]. Journal of Environmental Pathology Toxicology and Oncology，2000，19（3）：201-213.

[10]Schlenk D，Rice C D. Effect of zinc and cadmium treatment on hydrogen peroxide-induced mortality and expression of glutathione and metallothionein in a teleost hepatoma cell line[J]. Aquatic Toxicology，1998，43（2/3）：121-129.麻艳群，黄凯，于丹，等. 饲料磷脂水平对苏氏圆腹血清生化指标和肌肉磷脂含量的影响[J]. 江苏农业科学，2016，44（2）：274-276.