植物铜耐性机理的研究进展

李娟，全占军，张春晖，史娜娜，韩煜，王琦，张淇翔

1.中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院，北京100083

2.中国环境科学研究院，北京100012

植物铜耐性机理的研究进展

李娟1,2，全占军2,*，张春晖1，史娜娜2，韩煜2，王琦2，张淇翔2

1.中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院，北京100083

2.中国环境科学研究院，北京100012

主要从植物根细胞壁积累固定、细胞膜对铜的吸收控制、金属配体的螯合作用、铜在系统液泡的分隔机制及胁迫蛋白的合成5个方面，分别阐述植物对铜分子的耐性机制的研究进展，全面了解了铜在植物中的亚细胞分布、铜在植物根系到地上部分运输过程的转运机制以及植物在铜胁迫下的抗性反应等。并在此基础上提出了存在的问题以及今后研究的重点。

铜；植物；细胞膜；螯合作用；胁迫蛋白

李娟,全占军,张春晖,等.植物铜耐性机理的研究进展[J].生态毒理学报,2016,11(3):53-60

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铜是植物生长所必需的微量营养元素之一，其参与植物体内多种生理生化反应，是细胞色素氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、多酚氧化酶等胞内酶所必需的组分或辅酶，在植物光合、呼吸、抗氧化、细胞壁代谢以及激素反应中起着重要作用[1]。然而，过量的铜可能会抑制植物的光合作用及色素合成，且能够与细胞膜蛋白巯基结合，从而导致膜破坏，产生脂质过氧化反应，使细胞膜透性增加，造成膜内电解质和非电解质的外渗，破坏胞内环境的稳定性[2]。大量研究表明，低浓度Cu处理能够促进植物的生长，而高浓度Cu则抑制其生长[3-4]。不仅如此，在长期的进化过程中，生长于铜污染胁迫下的植物，逐渐在细胞内形成了严格的调控机制调节铜在植物体内的含量[5]。本文针对植物对铜的吸收控制机理及防御机理，主要从植物根细胞壁的固定机制、细胞膜对铜的吸收控制机理、金属配体的螯合作用、铜在细胞液泡的分割机理以及胁迫蛋白的合成5个方面总结植物对铜毒害的解毒作用机制。

1 植物对铜的吸收控制机理（Mechanism of plant absorbing and controlling copper）

1.1 根细胞壁固定机制

根细胞壁是重金属进入细胞的第一道屏障。长期生存在铜污染环境中的植物，大部分铜积累在植物根系，只有少量的铜会转移到地上部[4,6-7]，而根系中的铜又大多被吸附在根细胞壁上[8-11]，大大减少了铜离子向原生质体的跨膜运输，降低了铜的生物毒性，这是铜耐性植物抵抗铜毒害的重要机制。

细胞壁对重金属的吸附作用通过细胞壁中的多糖、蛋白质及木质素等组分提供的各种带负电的配位基团完成，这些配位基团主要包括羧基、羟基、醛基、氨基及磷酸基等[12]，其数量决定了细胞壁对重金属的吸附能力[13-14]。武贝等[15]经研究发现，海州香薷细胞壁纤维素和木质素中的羧基、氨基和羟基是铜的主要结合位点，且细胞壁结合Cu的分子形态类似于Cu-草酸、Cu-组氨酸以及水合态铜离子。随后，刘婷婷等[12]进一步研究发现，海州香薷根系中的果胶为铜离子提供了羟基官能团，纤维素和半纤维素为铜离子提供了羧基官能团，而细胞壁蛋白提供了氨基官能团等结合位点。Merdy等[16]发现，铜离子在小麦细胞壁上的结合位点主要是羧基和酚基。随后，又有研究发现，剑叶舌叶藓将过量的Cu累积在其原丝体的细胞壁上，且43%的Cu结合在果胶的同型半乳糖醛酸上[8]。这说明，不同植物的细胞壁结构及组成不同，其铜离子的结合位点及各组分在对铜离子吸附固定过程中所起到的作用不同，且细胞壁中的纤维素、半纤维素以及果胶在植物抗Cu毒过程中起到了关键作用。

另外，在植物对铜的耐性机制中，细胞壁不仅仅是铜的被动积累场所，在胁迫环境持续作用下，细胞壁也会发生一系列变化，而这种变化又增强了其对重金属的吸附能力，同时降低了微量金属元素向原生质体的渗透率[9]。例如，Liu等[17]发现随着土壤介质中铜含量的增加，各种细胞壁多糖的含量也相应增加，且其中包含较多羧基的细胞壁多糖为铜离子提供了更多的结合位点。此外，过量的铜也会影响胞内多糖在根细胞壁的分布，改变细胞壁的结构，这种改变不仅增加了细胞壁富集微量元素的能力，还降低了微量金属元素向原生质体的渗透性[9,17]。

1.2 细胞膜对铜的吸收控制机理

铜离子的吸收和其在细胞内的平衡由具体转运载体和金属泵控制，它们属于不同的植物金属转运蛋白家族，能够在组织水平或器官水平起作用[18]。Küpper等[19]研究发现，跨膜的金属转运蛋白在重金属的吸收、木质部的装载、卸载以及液泡区室化作用中可能起着决定性作用。近年来，对植物体吸收及运输铜的机制的研究取得了长足进步。目前已经发现了几种铜转运家族，包括COPT转运体、Cu运输P型ATP酶、铜伴侣蛋白等[20]。

COPT转运体在调控植物细胞对重金属Cu的吸收及分配中起到关键作用，主要负责细胞质膜对高亲和性Cu+的吸收[21-22]。通过质膜铜吸收系统突变体的功能互补筛选实验，在拟南芥中基因组中鉴定出6个编码COPT的基因，即COPT1-6，其中COPT1、COPT2、COPT3、COPT5、COPT6对Cu均具有很高的运输能力，最新发现的COPT6是位于细胞质膜上的铜吸收转运体，在铜缺失或过量时，对拟南芥体内铜含量的调控具有重要作用[22-25]。拟南芥中COPT1存在于拟南芥细胞质膜上[26]，能弥补酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)铜吸收缺失突变体，被认为是一个铜转运体，在植物吸收铜的过程中发挥重要作用[27-28]，COPT1基因主要在根尖、表皮毛、气孔、花粉和种胚等部位表达[28]，其表达受Cu负调控[22]，增加了植物对Cu毒性的敏感性[29]。目前，已有研究表明Cu以还原形式的Cu+进入细胞质[30]，且相对于家族内其他蛋白，COPT1对Cu+具有较高亲和力[22]。

Cu运输P型ATP酶能将无机阳离子运入或排出细胞，HMA重金属转运蛋白随其分布的组织、亚细胞定位以及金属特异性的不同而具备不同的功能。Baxter等[31]在拟南芥体内发现了P1B型ATPases的8个成员，并将其分别命名为AtHMA1-8，其中包括之前已经命名的PAA1(AtHMA6)，RAN1 (AtHMA7)，PAA2(AtHMA8)。AtHMA1-AtHMA4属于P1B-2型ATPases，为二价阳离子载体，如Cu2+、Cd2+等；而AtHMA5-AtHMA8属于P1B-1型ATPases，为一价阳离子载体，如Cu+，Ag+等[32]。Nuria等[33]通过对两个功能缺失突变体进行研究发现，AtHMA5能够将Cu+从细胞质运出胞外或运入相应器官，其在植物根部和花中大量表达，此外，酵母双杂交实验发现，铜分子伴侣ATX1或CCH相互作用能与AtHMA5的氨基端相互作用[34-35]。AtHMA1、AtHMA6都存在于叶绿体内膜上，分别通过不同的方式将Cu转运到叶绿体基质中[36-37]。经过对叶绿体被膜上的ATPase分析发现，AtHMA1的活性仅仅受到Cu的刺激，表明AtHMA1对铜具有特异性[37]。AtHMA8编码位于叶绿体类囊体上的Cu运输P型ATPases，可将叶绿体基质中的Cu+转运到类囊体腔中，Cu向质体蓝素的传递需要AtHMA6和AtHMA8共同作用[38]。Rodriguez等[39]发现RAN1(AtHMA7)是定位于内质网膜上的铜结合蛋白，在运输Cu到乙烯受体中起作用。然而，又由于RAN1与酵母中位于高尔基膜泡上的Cu+-ATPase Ccc2p的功能具有相似性，都负责将Cu+运输到ETR1[40]，故推测RAN1可能位于高尔基膜泡上。关于RAN1的定位及在植物中的功能还需要进一步确定。单子叶植物水稻(Oryza sativa)基因组中发现了9个基因，即OsHMA1-9[41]。水稻体内的OsHMA5负责将根系中的铜向木质部加载，参与铜在体内由根系向地上部的运输，且通过对OsHMA5抗体进行免疫染色，发现其定位于细胞质膜[42]。目前，对于HMAs的研究多集中于双子叶植物拟南芥，而对于单子叶植物中的HMAs的相关功能及研究较少，对其基因定位及功能尚需要更进一步的研究。

自从酵母中的铜伴侣蛋白ATX1被确认为Cu+的受体后，铜伴侣蛋白的概念逐渐为人们所知[43]，它能在细胞溶质中与低溶解性、高活性的Cu+结合，再把Cu传递给所需的亚细胞体[35,44]，保护细胞免受重金属毒害[22,45]。在植物体内的铜伴侣蛋白主要包括：CCH[44,46]、AtCOX17[47]、AtCCS[48]和AtATX1[49]。CCH是拟南芥中第一个被发现的铜伴侣蛋白[44]，含有植物特异的羧基端区域CTD和独特的结构特征，CCH能够在植物的韧皮部、叶柄和衰老的叶片等表达[46]。CCH与酵母中的ATX1为同源蛋白，能够将铜离子传递给与CCC2同源的RAN1，然后由RAN1将Cu传递给分泌道促使乙烯产生信号[49-51]。Puig等[35]发现高等植物体内含有两种类ATX1铜伴侣蛋白，即之前已经发现的CCH和AtATX1。AtATX1存在于细胞质中，能互补酵母atx1和sod1突变体的表型，通过酵母双杂交实验发现AtATX1能够将Cu+转运给RAN1，但其转运效率低于CCH。Balandin和Castresana[47]发现了与酵母中COX17同源的AtCOX17，它能够将Cu传递给线粒体的细胞色素氧化酶复合体上。与酵母Ccs1p/Lys7p同源的AtCCS能够将Cu+转运到SOD1，其在叶绿体中行使功能，可能向机制中Cu/Zn SOD供应Cu+，保持Cu+在质体蓝素和SOD中的稳态含量，同时，AtCCS的ATX-like域对其铜伴侣蛋白的功能至关重要[52]。

2 植物对铜的防御机理（Mechanism of plant defensing copper）

2.1 金属配体的螯合作用

重金属进入根细胞后，特异性蛋白质会通过螯合作用调控铜在植物体内的生态平衡，一方面，保证足量的Cu来维持植物的正常代谢功能，另一方面，避免铜在体内过多积累而对植物产生毒害作用[53]。铜离子对多肽、巯基、羧基以及酚羟基均具有很强的亲和力，其经细胞膜进入细胞质后，以结合态存在于细胞中[29]，随后，经金属载体转运至相应的细胞器或液泡中储存。植物体内的金属配体主要包括有机酸、氨基酸、金属硫蛋白(metallothioneins,MTs)、植物螯合肽(phytochelatins,PCs)及其他低分子量化合物。

植物体内螯合铜的有机酸主要是柠檬酸、苹果酸和草酸，但不同种类植物螯合重金属的有机酸种类不同，且有机酸是否能够对植物体内铜起到解毒作用仍存在很大争议[54]。Murphy等[55]发现短期的K+外排可增加拟南芥对Cu的耐性，而此过程又伴随着柠檬酸的释放，且Cu促进了柠檬酸盐的释放。此后，Bernal等[56]也发现在大豆细胞悬浮液暴露于铜环境时，柠檬酸首先合成。目前，有机配体提高植物抗Cu毒的研究相对较少，有机酸是否能够提高植物耐Cu毒的能力及其作用机制需进一步研究。氨基酸(如组氨酸等)也可作为重金属的配位基，在重金属的解毒和耐受机制中发挥作用，能够通过巯基、氨基、羧基和铜离子结合，形成稳定的螯合物从而起到一定的解毒作用。White等[57]发现在大豆渗出物中铜主要与天冬酰胺和组氨酸结合，在番茄中主要与组氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺结合。经Cu处理后的耐铜品种B1139和敏感品种B1195两品种水稻木质部汁液中的各种氨基酸的含量均有所上升，其中丝氨酸含量最高、上升最快，然而，其在水稻木质部中与Cu在水稻木质部中的运输和解毒是否相关尚需要进一步研究[58]。

金属螯合蛋白对铜的螯合能力远大于其他配体[59]。MTs是一类富含半胱氨酸(Cys)残基，可以结合重金属的低分子量蛋白质。Guo等[60]已经通过研究证明了MTs在调节植物体内金属平衡的作用。过量的Cu经常诱导MTs的产生[61]，MTs可通过Cys残基上的巯基与铜离子结合形成无毒或低毒络合物，消除其毒害作用。Thomas等[62]将酵母中的金属硫蛋白(CUP1)引入烟草体内，发现在铜胁迫下植物体内的CUP1转录水平下降，但转基因植物叶片积累的铜含量较对照植物依然增加了2～3倍。另有研究发现过量表达OsMT2c的转基因拟南芥比野生植物对铜的耐性更强，且对ROS的清理能力也更强[63]。PCs是以谷胱甘肽为底物由PC合成酶催化而成的金属螯合肽[64]，和游离的重金属离子螯合形成无毒或低毒的化合物。虽然，PCs能够通过Cu离子诱导产生，但由于PC-Cu复合物并未在液泡中隔离，且PCs突变体对铜的敏感性较小，故推测PC的诱导合成不是植物解铜毒的主要机制[65]。随后，Lee和Kang[66]通过研究发现，过量表达拟南芥AtPCS1的Cd耐性转基因植物对铜不具有耐性，拟南芥突变体cad2-1对铜的耐性高于野生型植物，这些都说明PCs对铜并没有显著的解毒作用。

2.2 铜在细胞液泡的分隔机理

铜能够通过位于液泡膜上的金属载体从胞质转运至液泡中储存[15]。重金属转运蛋白及金属螯合蛋白通过与金属离子结合形成一种临时储存形式封存于液泡中，其中，液泡膜转运蛋白ABCCs在其向液泡的运输起到了关键作用。液泡含有多种蛋白质、有机酸、有机碱以及其他能够结合重金属的物质，这些物质都能与重金属离子结合从而降低其生物毒性[11]。研究发现，生长于铜污染环境中的骆驼刺(Alhagi camelorumFisch)并未产生明显的铜毒害症状，这是因为过量的铜大多被储存于植物叶片中的液泡(48%)和叶绿体(7%)中[67]。经过铜处理后的大蒜，铜主要聚集在根尖细胞的液泡中[68]。另外，通过投射电镜观察发现，某些被子植物液泡中积累了大量的铜离子[69]，泡泡草根细胞中的液泡膜上可见黑色沉积物[70]。以上研究结果均表明，液泡是除细胞壁以外的另一主要的重金属隔离位点，通过将Cu隔离在液泡中，减少铜离子在植物细胞质中的含量，从而抑制其对植物的毒害作用。Wu等[71]通过研究发现，在匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera)体内，铜以可溶或不可溶的复合物形态存在于细胞质或液泡中，蓄积在液泡中的铜离子是没有毒性的，这一耐性机制对一些地上部分含铜量高的植物，特别是低等植物和超积累植物具有尤为重要的作用。另外，除液泡以外，隔离作用也可以发生在质外体或特殊细胞中，如表皮细胞及毛状体中[4]。由于分离高纯度的液泡难度较大，对于铜是如何进入植物液泡以及铜是以何种形态存在于液泡中尚需要进一步深入研究。

2.3 胁迫蛋白的合成/抗氧化酶保护系统

铜逆境影响能够诱导胁迫响应蛋白的表达，从而使植物细胞适应胁迫环境[17]。通过蛋白质组分析，已经在多种植物中发现了多种重金属敏感蛋白，主要包括：抗氧化保护蛋白、与蛋白折叠相关的蛋白(如热激蛋白、伴侣蛋白和蛋白质二硫键异构酶)、病程相关蛋白及参与脂质代谢的蛋白、蛋白和离子转运蛋白，这些蛋白的表达量均在金属胁迫下上调[72]。张黛静等[73]通过KEGG富集分析发现，检测出的2 283个差异表达基因(DEGs)被注释到31个代谢途径中，涉及植物生长发育的各个方面。

许多研究表明，在Cu胁迫下植物体内的多种蛋白出现上调或下调现象[61,63,74-75]。Smith等[76]研究发现，铜胁迫下拟南芥种子中AtGSTF2，AtGSTF6，AtGSTF7和AtGSTU19的RNA表达提高，这与张黛静等[73]研究发现的铜胁迫下小麦谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)等抗性蛋白质表达升高一致，这说明GSTs在植物低于重金属铜毒害中发挥了重要的作用。Li等[77]利用蛋白质组学方法研究小麦中铜胁迫响应蛋白的种类，在其根系和叶片中分别发现了49种和44种差异表达蛋白。其中，信号传导、胁迫防御、能量代谢等方面的功能蛋白丰度显著上调，而在糖代谢、蛋白质代谢以及光合作用方面的功能蛋白丰度显著降低。Chen等[75]通过对比研究抗铜水稻品种B1139和铜敏感水稻品种B1195根系对铜结合蛋白的差异性表达，两种水稻根系中的Cu-IMAC结合蛋白含量在铜胁迫环境下高于对照，而B1139根系中的Cu-IMAC结合蛋白含量高于B1195。这说明Cu-IMAC结合蛋白对植物对铜的耐性和解毒能力的增强发挥了积极的作用。同时，通过MALDITOF/TOF MS发现了34种差异性表达的蛋白点，经数据库搜索后确定了27种铜结合蛋白。这些铜响应蛋白分别参与到植物的抗氧化防御和解毒，发病机理，基因转录调控，氨基酸合成，蛋白质合成、修饰、运输以及降解，细胞壁合成和分子信号转换等过程。

3 总结与展望（Summary and prospect）

铜污染是一个严重的环境问题，过量的铜会严重损害植物的细胞结构和细胞膜，抑制植物基本的运输和代谢功能，同时能够经过食物链的积累作用危害人类健康。目前，植物耐铜胁迫的机理大多集中于生理生化水平，且已经取得了很大的进展。研究植物耐铜胁迫的生理机制，可以全面了解铜在植物中的亚细胞分布、铜在植物根系到地上部分运输过程的转运机制以及植物在铜胁迫下的抗性反应等，促进富集重金属转基因植物的开发。但在分子水平上，植物对铜耐性和积累性的机理仍不明确，如植物细胞如何感应铜信号的刺激，植物耐铜的相关基因如何进行表达和调控，植物耐受铜的基因的鉴定、分离、克隆及其功能研究等还未进行较为深入的研究。随着分子生物学、蛋白组学以及分子遗传学等新兴技术的应用，在今后的研究中应集中从分子和蛋白水平上研究耐性植物和超积累植物细胞参与对重金属铜的解毒和耐性机理，进而利用分子遗传学手段创造培育出低积累、高耐性的农作物新品种以及生长快、高生物量、高积累的超富集植物新品种。

致谢：感谢中国环境科学研究院张风春老师在文章修改中给予的帮助。

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Research Progress of the Tolerance Mechanism of Plants to Copper

Li Juan1,2,Quan Zhanjun2,*,Zhang Chunhui1,Shi Nana2,Han Yu2,Wang Qi2,Zhang Qixiang2

1.School of Chemical and Environmental Engineering,China University of Mining&Technology(Beijing),Beijing 100083,China
2.Chinese Research Academy of Environmental Sciences,Beijing 100012,China

20 July 2015 accepted 11 November 2015

Research progress of the tolerance mechanism of plants to copper was reviewed in five aspects:i)the copper accumulation of plant cell wall;ii)the absorption and control of plant membrane;iii)the chelation of metal ligands;iv)the separation of vacuole;and v)the synthesis of Cu-responsive proteins.The review provided us a better understanding of the subcellular distribution of copper in plant,the transport mechanism of copper from root to shoot of plants and the resistance of pants under copper stress.Based on the progress,the prospects of future studies were suggested.

copper;plant;plasma membrane;chelation;tolerance stress proteins

2015-07-20 录用日期：2015-11-11

1673-5897（2016）3-053-08

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150720002

简介：全占军(1979—)，男，博士，副研究员，主要研究方向为恢复生态学。

中央级公益性科研院所基本科研业务专项(2013-YSKY-14)；云南省环境保护厅生物多样性保护专项“滇池土著水生植物保育区构建示范研究”

李娟(1990-)，女，硕士生，研究方向为重金属污染土壤生态修复，E-mail:jjlife307@126.com

*通讯作者（Corresponding author），E-mail:quanzj@craes.org.cn