成簇规律间隔短回文重复系统的结构、作用机制及应用

陈 瑾， 王素英， 董世瑞

(天津市食品生物技术重点实验室 天津商业大学 生物技术与食品科学学院， 天津 300134)



成簇规律间隔短回文重复系统的结构、作用机制及应用

陈 瑾， 王素英， 董世瑞

(天津市食品生物技术重点实验室 天津商业大学 生物技术与食品科学学院， 天津 300134)

成簇的规律间隔短回文重复(CRISPR)是一类广泛分布于细菌和古细菌基因组中的DNA重复结构。重复结构与前导序列、一系列相关蛋白一起，为原核生物提供抵御噬菌体和质粒等外源基因的获得性免疫能力。综述了CRISPR系统的结构、作用机制及应用，介绍了最新的研究成果，并对其发展前景进行了展望。

CRISPR；原核生物；外源基因；免疫

原核生物在长期进化中逐渐形成一段成簇的规律间隔短回文重复结构，是针对噬菌体等外源DNA的获得性免疫系统，在大约40%的细菌和90%的古细菌基因组中均存在这一结构[1-3]。1987年，日本大阪大学的科研小组在研究大肠杆菌(Escherichiacoli)K12的碱性磷酸酶基因时发现其末端有一段串联间隔重复序列，该序列包括14个29 bp的重复序列及32～33 bp的间隔序列[4]。2002年，Jansen等[5]将这种结构命名为Clustered regularly interspaced short palindromic repeats。2005年，MOJICA等[6]发现该结构中的间隔序列与噬菌体的DNA序列同源性较高，判断其可能与细菌的免疫防御作用机制有密切关系。从2013年开始，已利用CRISPR介导的基因编辑技术实现对人类细胞、果蝇、细菌、小鼠等模式生物基因的遗传改造操作，从不同方面发掘出CRISPR的应用价值[7-10]。

细菌和古细菌通过CRISPR免疫系统吸收侵入的噬菌体DNA，作为间隔序列插入到自身基因组中，转录形成的RNA与二次入侵的外源DNA通过碱基互补配对的方式结合，并在Cas蛋白的作用下降解外源DNA[11]，使其无法进行转录和翻译。根据Cas基因核心序列的差异将CRISPR/Cas系统分为3种类型。Ⅰ型系统中包括6个Cas蛋白，其中Cas3蛋白具有DNA酶及解旋酶活性[12]；Ⅱ型系统以Cas9蛋白及向导RNA为核心。Cas9蛋白在CRISPR RNA(crRNA)的成熟过程中起作用，能够靶向降解外源DNA[13]；Ⅲ型系统以Cas6蛋白为核心，能够引导成熟的crRNA到达特殊的Cas剪切复合体中[14]。目前应用范围最广的是相对更简单的CRISPR/Cas9系统。

本文介绍了CRISPR/Cas系统的结构、作用机制和应用等方面的研究进展，阐述了未来的发展前景及可能出现的问题。

1　CRISPR的结构和作用机制

CRISPR系统由前导序列、CRISPR基因座、Cas基因3个部分组成。CRISPR基因座由一段间隔的串联重复序列(Direct Repeat, DR)和插入其中的差异的间隔序列(Spacer)组成，其中重复序列为21～48 bp[2]，包括一段5～7 bp的回文序列，具有稳定的茎环结构[1,5]；而间隔序列为26～72 bp，来自噬菌体、质粒等外源DNA序列。Cas基因是CRISPR位点附近的一系列相关基因，一般包含4～10个保守基因[2]，其转译的Cas蛋白具有重要作用。根据Cas基因的保守程度将其分为核心Cas基因、RAMP组件基因和亚型特异性Cas基因[15]。所有CRISPR结构中均含有Cas1～6基因，因此被称为核心Cas基因，且Cas1～2基因存在所有CRISPR系统中，在解旋酶、核酸酶、聚合酶、RNA结合等结构域均发现有Cas1～2蛋白的存在[15-16]。前导序列(Leader)位于CRISPR的5′端，是一段300～500 bp、种内保守但种间有差异、富含AT碱基的序列，与第一个重复序列直接相连[16]。前导序列为新的间隔序列的插入提供了识别位点[8]，并且促进CRISPR基因座的转录过程[7]。

CRISPR/Cas系统抵御噬菌体或质粒等外源遗传物质的入侵过程分3个阶段，即适应阶段、表达阶段和干扰阶段[17]。在适应阶段，当外源噬菌体侵入时，其短的DNA序列插入到细菌基因组中前导序列和第一个重复序列之间，同时再产生一个重复序列；在表达阶段，重复-间隔序列转录成长链RNA，此为CRISPR RNA前体(Pre-crRNA)，随后被切割并加工成小的成熟的crRNA，并与Cas基因翻译出的具有内切酶功能的Cas蛋白形成特殊的crRNA/Cas复合体；最后在干扰阶段，当细菌再次被外源DNA侵染时，crRNA会与外源DNA序列互补配对，通过复合体的作用降解外源DNA，以此维持细菌基因组的稳定性。

2 CRISPR的应用领域

2.1基因修饰

RNA干扰(RNAi)技术是真核生物常用的基因修饰技术；对于原核生物，传统的基因修饰技术主要包括锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)。ZFNs和TALENs是以人工开发的特异性DNA结合蛋白作为靶标定位工具，成本高；而CRISPR是利用RNA来定位靶标，容易实现；CRISPR技术操作简单、方便且迅速，而且CRISPR/Cas9的切口酶定位精确，安全性高，因此应用前景较广泛，不仅推进基因编辑技术的发展，还在某些疑难问题解决方面显示出一定的优越性，如在CRISPR基因编辑技术出现之前，人们对引起免疫力较低人群致命感染的白色念珠菌无能为力，2015年Vyas等[18]对CRISPR/Cas系统进行了改造，设计得到能够作用于98%的白色念珠菌基因组和绝大多数真菌的CRISPR/Cas系统。改造后的CRISPR/Cas系统能够同时使抗生素抗性基因和必需基因的两个拷贝同时突变，效果显著。

2.2细菌的分子分型和进化分析

CRISPR结构的重复序列在种内保守，因此CRISPR位点在细菌分子分型中具有高分辨率[7-8]。相对于传统的分型方法，CRISPR技术操作更加简便迅速，具有高效性。目前基因分型的主要方法是T7E1内切酶法。而Zhu等[19]通过CRISPR/Cas9系统建立了6个株系的基因组修饰小鼠，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法对从F0至F2代的小鼠进行了基因分型，灵敏度可达到0.5%。证明利用CRISPR/Cas9系统的PAGE分型法比T7E1内切酶法更简便高效，满足了基因分型更高的要求。在细菌抵抗外源遗传物质的过程中，外源DNA作为新的间隔序列插入细菌基因组中使细菌获得对外源遗传物质的免疫记忆，且新的间隔序列总是插入前导序列和第一个重复序列之间。从间隔序列的排列顺序变化可以得到细菌在不同时间及空间遭受外源遗传物质的侵染，反映了细菌的进化过程。

2.3疾病治疗

由于CRISPR/Cas9系统在基因编辑技术中表现的精确性，研究者已将其用于疾病的诊断与治疗。研究表明，利用CRISPR/Cas9系统对CXCR4进行基因组编辑可赋予细胞抵抗I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的能力[20]。HIV-1可利用CXCR4进入细胞。研究人员利用CRISPR/Cas9系统将CXCR4功能缺失突变株导入某些细胞中，赋予了被改造细胞对HIV-1的抵抗力。亨廷顿氏病(Huntingtons disease)是由能够破坏大脑的突变蛋白引起的一种神经系统疾病。研究人员利用病毒作为载体感染两组健康小鼠，通过CRISPR/Cas9系统和突变基因的靶DNA对其中一组进行治疗，效果显著[21]。

2.4器官或组织修复

研究人员利用CRISPR/Cas9技术改造人体血管内皮细胞，Cas9蛋白能清除CIITA基因，而CIITA基因编码调控II型主要组织相容性复合物(MHC)的转录因子。利用CRISPR/Cas9系统对基因进行敲除，使细胞无法激活T细胞[22]，从而不能对外源物质产生免疫应答反应，保证系统的正常运行。结果证明利用CRISPR/Cas9技术有助于器官修复或组织工程的研究。

3　CRISPR系统的重要进展

随着CRISPR/Cas系统的研究热潮，其优势得到了很好的体现，突破性的研究进展不胜枚举。例如，Wong等[23]通过分析CRISPR的转录组数据，揭示了功能性向导RNA的特点，提供了设计向导RNA的新工具。只需在细胞中表达Cas9蛋白和向导RNA，Cas9蛋白会在向导RNA的作用下引入位点特异性的双链断裂，细胞通过同源重组进行修复，实现对基因组中特定位点的编辑。Gantz等[24]利用CRISPR/Cas9技术研发出一个新系统，利用它可以将一种杂合突变转变成一种纯合突变，即等位基因同时发生突变。纯合突变时表型才会发生变化，这样节省了人力物力。CRISPR/Cas9技术的编辑时间较长，无法灵活掌控。而Davis等[25]开发出一种能被类药物小分子激活的Cas9酶形式，其活性可以暂时性的爆发，一段时间后酶活性下降，这种变化不会影响细胞进程。结果表明这种可被激活的Cas9形式的编辑速度比传统的Cas9形式快25倍。Cas1和Cas2可以形成稳定的复合体，发挥整合酶作用将获得的新间隔序列插入到CRISPR位点中。Wang等[26]研究大肠杆菌中Cas1/Cas2复合物时发现其能够与双叉形式的前间隔序列相结合，而前间隔序列的3′端的侧翼序列对于获得新间隔序列尤为重要。因为侧翼序列中存在PAM互补序列，此序列可被Cas1酶特异性识别并切割，切除5 bp左右的序列长度，剩余的DNA序列可插入到CRISPR位点中。研究结果揭示了依赖于PAM获得新间隔序列的重要机制。

4　结论

CRISPR/Cas技术从问世到现在不到30年的时间，从2013年开始报道了许多研究成果以及发表了大量的论文，研究者对其的热衷程度可见一斑。作为原核生物在进化过程中逐渐形成的一种免疫防御系统，CRISPR/Cas系统越来越展现出它的优越性，在基础研究、医学、农业及食品工业等领域发挥着重要作用，相信未来在很多方面都会有更广泛的应用价值。但是关于CRISPR/Cas介导的基因编辑技术的争议也备受关注，有科学家利用此项技术对一些动物的生殖细胞进行改造，也许之后会对人体生殖细胞进行改造，这样就涉及伦理道德的争论问题。通过CRISPR技术人类可以消除疾病，但涉及改造人体生殖细胞的问题，这种行为属于全球禁止的。一旦CRISPR技术被允许用于生殖细胞的改造工程，后果无法预料。凡事均有两面性，究竟未来关于CRISPR技术的评判如何，还要依靠道德和法律的约束。不过我们始终相信，作为新一代基因编辑技术的强大工具，人类可以很好地运用这项新技术，最终造福社会。随着人类想象力及创造力的不断提升，CRISPR/Cas技术一定还有更广的拓展方面和更大的应用价值。

[1]KUNIN V, SOREK R, HUGENHOLTZ P. Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats[J]. Genome Biology, 2007, 8(4): 61.

[2]GRISSA I, VERGNAUD G, POURCEL C. The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats[J]. BMC Bioinformatics, 2007, 8: 172.

[3]MOJICA F J M, CESAR D EZ-VILLASE OR, SORIA E, et al. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria[J]. Molecular Microbiology, 2000, 36(1): 244-246.

[4]ISHINO Y, SHINAGAWA H, MAKINO K, et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion inEscherichiacoli, and identification of the gene product[J]. Journal of Bacterioogyl, 1987, 169(12): 5429-5433.

[5]JANSEN R, EMBDEN J D, SCHOULS L M, et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Molecular Microbiology, 2002, 43(6): 1565-1575.

[6]MOJICA F J, D EZ-VILLASE OR C, GARC A-MART NEZ J, et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements[J]. Journal of Molecular Evolution, 2005, 60(2): 174-182.

[7]LILLESTØL R K, REDDER P, GARRETT R A. A putative viral defence mechanism in archaeal cells[J]. Archaeaan International Microbiological Journal, 2006, 2(1): 59-72.

[8]POURCEL C, SALVIGNOL G, VERGNAUD G. CRISPR elements in Yersinia pestisacquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies[J]. Microbiology, 2005, 151(Pt 3): 653-663.

[9]BOLOTIN A, QUINQUIS B, SOROKIN A, et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats(CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin[J]. Microbiology, 2005, 151(Pt 8): 2551-2561.

[10]PRANGISHVILI D, FORTERRE P, GARRETT R A. Viruses of the Archaea: a unifying view[J]. Nature Reviews Microbiology, 2006, 4(11): 837-848.

[11]HELER R, MARRAFFINI L A, BIKARD D. Adapting to new threats: the generation of memory by CRISPR-Cas immune systems[J]. Molecular Microbiology, 2014, 93(1): 1-9.

[12]SINKUNAS T, GASIUNAS G, FREMAUX C, et al. Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system[J]. Embo Journal, 2011, 30(7): 1335-1342.

[13]DELTCHEVA E, CHYLINSKI K, SHARMA C M, et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III[J]. Nature, 2011, 471(7340): 602-607.

[14]WANG R, PREAMPLUME G, TERNS M P, et al. Interaction of the Cas6 riboendonuclease with CRISPR RNAs: recognition and cleavage[J]. Structure, 2011, 19(2): 257 264.

[15]HAFT D H, SELENGUT J, MONGODIN E F, et al. A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes[J]. PLoS Computational Biology, 2005, 1(6): e60.

[16]MAKAROVA K S, GRISHIN N V, SHABALINA S A, et al. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action[J]. Biology Direct, 2006, 1: 7.

[17]MARRAFFINI L A, SONTHEIMER E J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea[J]. Nat Rev Genet, 2010, 11(3): 181-190.

[18]VYAS V K, BARRASA M I, FINK G R. A CRISPR system permits genetic of essential genes and gene families[J]. Science Advances, 2015, 1(3): e1500248.

[19]ZHU X, XU Y, YU S, et al. An Efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 System[J]. Scientific Reports, 2014, 4: 6420.

[20]HOU P, CHEN S, WANG S, et al. Genome editing of CXCR4 by CRISPR/cas9 confers cells resistant to HIV-1 infection[J]. Scientific Reports, 2015, 5: 15577.

[21]HANAE A. Gene-editing method halts production of brain-destroying proteins[N]. Science, 2015-10-20.http://www.sciencemag.org/news/2015/10/gene-editing-method-halts-production-brain-destroying-proteins.

[22]ABRAHIMI P, CHANG W G, KLUGER M S, et al. Efficient gene disruption in cultured primary human endothelial cells by CRISPR/Cas9[J]. Circulation Research, 2015, 117(2): 121-128.

[23]WONG N, LIU W, WANG X. WU-CRISPR: characteristics of functional guide RNAs for the CRISPR/Cas9 system[J]. Genome Biology, 2015, 16(1):1-8.

[24]GANTZ V M, JASINSKIENE N, TATARENKONA O, et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015, 112(49): e6736-6743.

[25]DAVIS K M, PATTANAYAK V, THOMPSON D B, et al. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specilicity[J]. Nature Chemical Biology, 2015, 11(5): 316-318.

[26]WANG J, LI J, ZHAO H, et al. Structural and mechanistic basis of PAM-dependent spacer acquisition in CRISPR-Cas systems[J]. Cell, 2015, 163(4): 840-853.

The structure, mechanism and application of clustered regularly interspaced short palindromic repeats system

CHEN Jin, WANG Su-ying, DONG Shi-rui

(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is a kind of repetitive DNA structure, which is widely distributed in bacterial and archaeal genomes. The structure with leader sequence and a series of associated proteins together provide acquired immunity against phage and plasmid genes for prokaryotes. In this paper, the structure, mechanism and application of CRISPR system are summarized, the latest research progress is introduced, and the prospect of its development is prospected.

CRISPR; prokaryote; foreign gene; immune

2015-11-23；

2015-12-17

国家自然科学基金项目(31270050);天津市教委高等学校科技发展基金计划项目(20130624)；天津市高等学校创新团队(TD12-5049)

陈瑾，硕士研究生，研究方向为微生物资源开发与利用，E-mail:398358677@qq.com

董世瑞，博士，副教授，研究方向为生物技术，E-mail:dongshirui@tjcu.edu.cn

Q78;Q93

A

2095-1736(2016)05-0087-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.087