烧伤病房鲍曼不动杆菌耐药性及OXA基因型检测

吕大伦 陈 雷 丁 伟 徐姝娟 张 炜 王合丽 王 帅

（皖南医学院第一附属医院烧伤整形外科，安徽 芜湖 241001）

烧伤病房鲍曼不动杆菌耐药性及OXA基因型检测

吕大伦 陈 雷 丁 伟 徐姝娟 张 炜 王合丽 王 帅

（皖南医学院第一附属医院烧伤整形外科，安徽 芜湖 241001）

目的：了解烧伤病房患者创面鲍曼不动杆菌的耐药性和OXA碳青霉烯酶基因携带情况，为预防和控制多重耐药鲍曼不动杆菌医院感染提供依据。方法：收集2013年1月—2015年12月皖南医学院第一附属医院烧伤整形外科收治2 572例患者创面分泌物进行细菌培养；使用VITEK 2 Compact型全自动微生物检测仪鉴定鲍曼不动杆菌，通过药敏实验检测其对18种抗菌药物的敏感性；应用聚合酶链反应(PCR)方法检测4种OXA碳青霉烯酶基因(OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-51-like、OXA-58-like)的携带情况，并对其中10株进行OXA-23-like基因测序。结果:分离出44株鲍曼不动杆菌，对亚胺培南耐药率为79.55%（27株），对米诺环素及替加环素的耐药率较低，分别为20.45%（9株）和31.82%（14株)，对庆大霉素耐药率高达100%，对其他抗菌药物也具有较高的耐药率(59.09%～97.73%)。所有菌株OXA-51-like基因均为阳性，共有35株OXA-23-like基因阳性（阳性率79.55%），均未检测到OXA-24-like基因和OXA-58-like基因。结论：鲍曼不动杆菌呈多重耐药现象，对米诺环素耐药率最低，我院创面鲍曼不动杆菌主要耐药机制可能与OXA-23-like基因有关。

鲍曼不动杆菌 OXA基因 耐药性 碳青霉烯酶

鲍曼不动杆菌是一种革兰阴性杆菌，它具有非发酵性和氧化酶阴性，且自身没有动力。鲍曼不动杆菌引起的烧伤患者创面感染率逐年升高，更引人担忧的是其耐药率逐年上升。碳青霉烯类抗菌药物（亚胺培南和美罗培南等）是一类具有抗菌谱广、杀菌活性强的抗生素，是临床上治疗鲍曼不动杆菌感染最重要的抗菌药物。自从1991年首先在美国发现耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌以来，碳青霉烯类抗生素耐药现象日益严峻，给临床抗感染治疗带来严峻挑战。为了解鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及其耐碳青霉烯酶基因OXA与耐药性的关系，本研究分析了来自我院烧伤整形科44例烧伤患者的44株鲍曼不动杆菌的耐药情况，并进一步研究耐碳青霉烯酶基因OXA的携带情况。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 电泳仪、PCR仪和凝胶成像系统（BioRad公司），比浊仪、药物敏感检测卡和VITEK 2 Compact型全自动微生物检测仪（法国生物梅里埃公司），DNAMakerⅢ(北京天根生化科技有限公司)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；DNA凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)，DL l 000 DNA Marker及TA克隆试剂盒(TaKaRa公司)。

1.2 菌株来源和鉴定 我院烧伤整形外科病房2013年1月—2015年12月共收治2 572例患者，患者于入院后立即或住院后发现创面出现脓性分泌物时采集创面分泌物，送检验科细菌培养，VITEK 2 Compact型全自动微生物检测仪进行菌种鉴定，从44例患者的90个创面中共分离出44株鲍曼不动杆菌。44例患者中男28例，女16例；年龄2～85岁，平均（53.11±18.13）岁。感染创面包括糖尿病足创面、烧创伤创面、压疮创面及其他创面。

1.3 病原微生物培养和药物敏感试验 44株非重复鲍曼不动杆菌分离后于-80 ℃冰箱保存，所有菌株进行药物敏感试验。质控菌株购自卫生部临床检验中心，分别为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853，参照《全国临床检验操作规程》，应用全自动微生物检测仪进行菌种鉴定和药物敏感试验。抗菌药物选用头孢唑林、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮／舒巴坦、头孢吡肟、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、亚胺培南、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、庆大霉素、阿米卡星、米诺环素、替加环素、复方新诺明，共18种。MIC结果判定参照美国临床和实验室标准化协会2013年标准（M100-S23），另外头孢哌酮/舒巴坦的药敏试验采用K-B纸片扩散法，结果判断参照M100-S23头孢哌酮的标准[1]。

1.4 细菌DNA提取 采用煮沸法制备。制备后模板-20 ℃保存备用。

1.5 OXA酶基因检测 PCR扩增基因扩增引物参照文献［2］设计，设计为OXA-23 OXA-23A* ： 5’-CTATTTTTGTCGTGTACAGAGC-3’；OXA-23B* ： 5’-GGATCACAACAACTAA AAGCACTG-3’。以PCR法，检测OXA-23-like、OXA-23R，OXA-24-like、OXA-24R，OXA-51-like、 OXA-51R，OXA-58-like和OXA-58R。PCR反应体系体积30 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 50 s，共 35个循环，72 ℃ 延伸10 min。标本4 ℃下保存。PCR扩增终末产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像仪下观察结果并拍照。

1.6 统计学分析 采用WHONET5.5软件。细菌耐药率=耐药菌株数/总菌株数×100%。

2 结 果

2.1 药敏实验结果 鲍曼不动杆菌对临床常用的18种常用抗生素的耐药率分别是：头孢唑林93.18%（41株），头孢他啶75.00%（33株），头孢曲松77.27%（34株），头孢哌酮／舒巴坦59.09%（26株），头孢吡肟79.55%（27株），氨苄西林84.09%（37株），氨苄西林/舒巴坦72.73%（32株），哌拉西林/他唑巴坦70.45%（31株），氨曲南86.36%（38株），亚胺培南79.55%（35株），环丙沙星79.55%（35株），左氧氟沙星81.82%（36株），莫西沙星77.27%（34株），庆大霉素100%（44株），阿米卡星97.73%（43株），米诺环素20.45%（9株），替加环素31.82%（14株），复方新诺明77.27%（34株）。

2.2 OXA酶基因检测结果 PCR检测44株临床分离的鲍曼不动杆菌的4类OXA型耐药基因（OXA-23-like、OXA-24-like、OXA-51-like、OXA-58-like），发现所有菌株OXA-51-like基因均为阳性，其中35株（79.55%）OXA-23-like基因阳性，44株鲍曼不动杆菌均未检测到OXA-24-like基因和OXA-58-like基因。见图 1。

图1 鲍曼不动杆菌菌株4种OXA酶基因凝胶电泳

2.3 OXA-23-like基因全序列PCR 在35株OXA-23-like基因阳性的菌株中随机挑选10株进行OXA-23-like基因全序列PCR扩增，PCR实验及琼脂糖电泳结果显示有9株菌扩增出OXA-23-like基因的全序列，1株未扩增出OXA-23-like基因。见图2。

图2 全序列OXA-23-like基因凝胶电泳

3 讨 论

从我院近3年烧伤病房患者创面鲍曼不动杆菌耐药检测分析，我院烧伤病房患者创面鲍曼不动杆菌耐药现象非常严峻，尤其对临床上常用的碳青霉烯类抗生素也有较高的耐药率。本组资料中，鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率达79.55%，仅对米诺环素（耐药率20.45%）、替加环素（耐药率31.82%）具有较高敏感性[3]。提示应该加强防控，减少患者鲍曼不动杆菌感染机会，减轻耐药状况。

质粒介导的 OXA58型青霉烯酶于2003年被首次报道, OXA-23是最早被鉴定出的OXA-23-like型碳青霉烯酶，首次被发现于一株亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌中。OXA23是鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药最主要的碳青霉烯酶[4]，鲍曼不动杆菌可能是通过产生能水解碳青霉烯类药物的OXA23基因，通过质粒介导的 OXA23基因引起多重耐药。OXA-23-like酶属于D类碳青霉烯酶家族[1]，由于此类酶的编码基因常位于鲍曼不动杆菌的质粒上，极易通过质粒介导的耐药基因转移机制造成克隆播散，目前OXA-23已在世界范围内广泛流行[5]。

本实验检测了烧伤患者的44株鲍曼不动杆菌的4组OXA基因，发现所有菌株均携带有OXA-51-like基因（100%），有35株OXA-23-like基因阳性（79.55%），44株鲍曼不动杆菌OXA-24-like基因和OXA-58-like基因的PCR实验均为阴性；结果说明我院烧伤病房鲍曼不动杆菌的OXA基因流行基因型除了天然携带的OXA-51-like基因外，以OXA-23-like基因为主[6-7]。本实验的菌株不论是否对碳青霉烯类抗生素耐药均检测到OXA-51-like基因，与以往研究认为OXA-51-like基因为鲍曼不动杆菌固有的耐药基因的结论相符，也说明了鲍曼不动杆菌是否耐碳青霉烯类抗菌药物与OXA-51-like基因的存在不相关，由于OXA-51-like基因的表达有赖于基因上游存在插入序列ISAbal，并且OXA-51-like酶对碳青霉烯类抗生素具有较弱的水解能力[8]，说明OXA-51-like基因可能不是导致鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。

通过分析药敏试验可知临床医师治疗由多重耐药鲍曼不动杆菌引起的感染时，可选用的抗菌药物非常有限，应引起高度重视。同时鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗菌药物可能是由其携带了OXA-23-like耐药基因造成，所以医生要了解本科室患者鲍曼不动杆菌的耐药特性，加强OXA-23-like耐药基因的检测及监控，防止OXA-23-like耐药基因在病房和医院内的流行播散；同时加强临床联合用药的意识，合理选用抗菌药物。

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Detection of drug resistance and OXA genotypes in Acinetobacter baumannii isolated from patients of burn units

Lv Dalun, Chen Lei ,Ding Wei, Xu Shujuan, Zhang Wei, Wang Heli, Wang Shuai. Department of Burns and
Plastic Surgery, the First Affiliated Hospital, Wannan Medical College, Wuhu 241001, Anhui, China

Objective: To investigate the drug resistance and OXA gene carrying case of Acinetobacter baumannii isolated from burn patients to provide a basis for prevention and control of hospital infection induced by multi-drug resistant Acinetobacter baumannii. Methods: Bacterial culture of wound secretion was performed in 2 572 burn patients admitted to the Burns and Plastic Surgery of the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College from January 2013 to February 2015. VITEK 2 Compact automatic microbial detection system was used to identify Acinetobacter baumanii, and its susceptibility to 18 kinds of antimicrobial were tested. Four kinds of OXA carbapenemase genes (OXA-23-like, OXA-24-like, OXA-51-like, OXA-58-like) in Acinetobacter baumannii were detected by polymerase chain reaction, and OXA-23-like gene was sequenced in 10 strains. Results: Totally 44 strains of Acinetobacter baumannii were isolated, and the resistance rate to imipenem was 79.55% ( 27 strains), they were lower to Minocyline and tigecycline (20.45%, 9 strains and 31.82%,14 strains respectively) , but high (100%) to gentamicin, and maintained at higher resistance rate to other antibiotics (59.09%-97.73%). In all strains of Acinetobacter baumannii, the OXA-51-like genes were positive, and a total of 35 OXA-23-like genes-positive strains (79.55%) were detected, while no OXA-24-like gene and OXA-58-like gene positive strains were found. Conclusions: Acinetobacter baumannii showed multiple drug resistance, the resistance rate to minocycline is low. The mechanism of multi-drug resistance of Acinetobacter baumannii in our hospital may be related mainly to OXA-23-like genes.

Acinetobacter baumannii; OXA genes; Drug resistance; Carbapenemase

2016-12-05)

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 04. 004

安徽省芜湖市科技惠民计划（2012hm30）