内皮祖细胞移植对急性肺损伤大鼠的抗炎效应

李 辉 苏 伟 许东琳 傅永鸿 陈伟明 周 慧 杨自力

(广州医科大学附属广州市第一人民医院重症医学科，广东 广州 510180)

·论著·

内皮祖细胞移植对急性肺损伤大鼠的抗炎效应

李 辉 苏 伟 许东琳 傅永鸿 陈伟明 周 慧 杨自力*

(广州医科大学附属广州市第一人民医院重症医学科，广东 广州 510180)

目的:研究内皮祖细胞(EPC)移植对急性肺损伤(ALI)大鼠的抗炎效应。方法：将60只雄性SD大鼠随机分为对照组、ALI组、EPC组，每组各20只。ALI组和EPC组采用LPS(5 mg/kg)静脉注射制备ALI模型，EPC组在造模成功半小时后予EPC悬液移植，观察3组干预过程中血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平的变化，以及肺湿/干重比值(W/D)、TLR9表达和NF-κB活性的变化。 结果：造模后ALI组和EPC组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、和IL-10水平均显著升高(P<0.05)。造模7 d后，EPC组大鼠TLR9表达和NF-κB活性显著低于ALI组(P<0.05)，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平也低于ALI组(P<0.05)。 结论：EPC移植可以减轻ALI大鼠的炎症反应，具有一定的抗炎效应。

内皮祖细胞移植；急性肺损伤；大鼠；细胞因子

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是临床常见的危重症，死亡率高达40%，其发病机制尚未完全清楚[1]。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，在外周循环中对血管内皮的形成、分化及修复起到重要作用[2-3]。研究表明，EPCs参与人胚胎血管形成，同时参与出生后血管新生和内皮损伤的修复过程[4]，还具有免疫调节作用，能参与炎症反应的组织修复[5-7]。本研究通过观察ALI大鼠在EPCs移植干预后血清炎症介质及肺组织TLR9表达和NF-κB活性的变化，探讨EPCs移植对ALI发病过程的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级健康雄性SD大鼠60只，体质量250～300 g，随机分为对照组、ALI组、EPC组，每组各20只。另外选取清洁级健康SD大鼠60只，6周龄，体质量100～150 g，用于EPC的采集。所有实验动物由广州医科大学动物实验中心提供。

1.2 制备模型和获取标本

1.2.1 制备模型 将大鼠固定于动物实验台，经尾静脉注射脂多糖(LPS)5 mg/kg，即得内毒素致ALI动物模型。对照组仅注射等量的生理盐水。

1.2.2 获取标本 造模第7天活杀所有大鼠，即刻开胸取出双肺，取右肺10%组织送病理学检查，其余组织用于测量湿/干重比值(W/D)，左肺组织用于TLR9表达和NF-κβ活性检测。经鼠尾静脉取外周血，常温下静置2 h，5℃以3 000 r/min离心8 min，取上清液，以-80℃冰箱保存集中检测细胞因子。

1.3 EPCs的制备和移植

1.3.1 EPCs的体外培养及鉴定 取大鼠四肢长骨骨髓，Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞，接种于EGM2培养基(Hyclone公司，美国)与10%胎牛血清中，置37℃、5%CO2培养箱中培养7 d，前4天隔天换1/2液，第4天PBS洗去未贴壁的细胞，第7天换全液。制备细胞进行免疫双荧光法鉴定，双染色阳性的细胞即为正在分化的内皮祖细胞，光镜下可见梭形细胞，成簇状分布。激光扫描共聚焦显微镜下观察，可看到双染色阳性的正在分化的内皮祖细胞。胰酶消化后用无菌PBS稀释成细胞悬液备用(细胞浓度1×109/L)。

1.3.2 EPCs移植 造模半小时后，取1 mL制备好的EPCs细胞悬液经尾静脉注入EPC组大鼠，而ALI组大鼠同法仅给予等量的PBS。

1.4 血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的检测

采用商品化的ELISA试剂盒(美津生物公司)，按照说明书方法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的浓度。

1.5 肺组织湿重/干重(W/D)比值

取右肺上叶组织，用滤纸吸走表面附着的水分与血渍，称得湿重(wet weight，W)后将其置于60 ℃ 恒温箱中72 h至重量不再改变，取出称得干重(dry weight，D)，计算W/D比值。

1.6 TLR9表达的测定

取肺组织，使用Trizol法分离溶解组织并提取RNA，再取等量总RNA逆转录为cDNA。逆转录反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。再用RT-PCR 进行扩增，RT-PCR条件为94 ℃变性45 s，48 ℃退火45 s，72℃延伸90 s，共33个循环。采用荧光定量PCR仪检测TLR9在肺组织中的表达。

1.7 检测NF-κB活性

取肺组织，在冷PBS中匀浆，4 ℃ 3 000 r/min离心5 min，弃上清，洗2次。细胞沉淀用0.8 mL冷低渗盐溶液悬浮，加100 μL 10%NP-40裂解细胞，置冰浴上肿胀15 min，强烈震荡45 s，11 000 r/min，低温离心20 min。弃上清，用100 μL细胞核蛋白提取缓冲液重悬沉淀，4 ℃震荡30 min，21 000 r/min，低温离心10 min，收集上清即为核蛋白提取物，-80 ℃保存待测。采用Mercury转录因子ELISA法测定试剂盒集中测定肺组织NF-κB活性。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 EPCs移植对血清炎症介质水平的影响

造模7 d后，ALI组和EPC组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平均较造模前明显上升(P<0.05)，EPC组血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显高于对照组(P<0.05)，提示EPCs移植能显著降低ALI大鼠循环中促炎症介质水平，具有一定的抗炎效应。见表1。

表1 EPCs移植前后血清炎症介质的变化

注：与ALI组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

2.2 EPCs移植对肺组织炎症反应的影响

造模7 d后，ALI组W/D较对照组降低(P<0.05)；ALI组和EPC组肺组织TLR9表达和NF-κB活性均较对照组显著升高(P<0.05)，但EPC组肺组织TLR9表达和NF-κB活性显著低于ALI组(P<0.05)。见表2。

表2 EPCs移植前后W/D及TLR9表达、NF-κB活性的变化

注：与ALI组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

3 讨 论

ALI/ARDS的病因及发病机制错综复杂，致病环节众多，病死率高，已成为重症医学研究的热点和难点。ALI被认为是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的早期阶段，其发病过程由多种炎症介质及效应细胞共同参与，并呈级联放大的瀑布样炎症继发反应和继发性弥漫性肺实质损伤，其特征是广泛的肺微血管内皮细胞的坏死、凋亡及功能失调[8]。本研究结果显示，造模后ALI组和EPC组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等炎症介质水平都随时间推移有不同程度升高，提示炎症反应参与了ALI的发病过程。

Asahara等[10]描述了一群人类循环CD34+细胞，在体外经过分化后具有内皮细胞特征，这些细胞被称为“内皮祖细胞”。创伤后机体内缺血、缺氧以及血管内皮损伤是介导EPCs动员、归巢和分化的最显著信号。既然血管内皮细胞损伤是ALI发病过程的特征之一，理论上EPCs移植应对ALI的组织损伤具有一定的修复作用。本研究结果显示，造模7 d后EPC组血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平等促炎症介质较ALI组明显下降(P<0.05)，说明机体的炎症反应得到一定程度的改善，提示EPCs移植可在一定程度上阻止ALI的发病过程，并具有一定的抗炎效应。

NF-κB通路是TLR9依赖的MyD88-IRAK4-TRAF6信号转导的下游分支信号，其变化和炎症反应的发生和转归密切相关。本研究结果还显示，造模后ALI组和EPC组TLR9表达和NF-κB活性均较对照组增加，但EPC组TLR9表达和NF-κB活性则较ALI组下降，提示TLR9-NF-κB信号转导系统可能参加了ALI发病的炎性反应过程，内皮祖细胞可能通过下调TLR9-NF-κB信号系统从而弱化了ALI发病的炎性反应过程，具有一定的抗炎效应和肺保护作用。

综上所述，炎症反应在ALI发病过程中起着重要作用，TLR9信号通路可通过调节其下游的NF-κB等信号通路参与了炎症反应的调控，而EPCs移植则在ALI发病过程中一定程度上弱化了肺组织的炎症反应，推测具有一定的抗炎效应和肺保护作用，为治疗ALI提供了新的思路，因此，有待进一步研究明确EPCs移植干预ALI发病过程的具体机制，为临床上防治ALI提供可靠的理论基础。

[1] Beasley MB. The pathologist's approach to acute lung injury[J]. Arch Pathol Lab Med,2010,134(5):719-727.

[2] 李 伟，杨丽娟，吴忠仕.内皮祖细胸的来源及应用[J]. 中华生物医学工程杂志，2007,13(2):116-119.

[3] Burnham E,Moss M. Progenitor cells in acute lung injury[J]. Minerva Anestesiol,2006,72(6):369-374.

[4] Peichev M,Nalyer AJ,Pereira D,et al. Expression of VEGFR-2 and ACl33 by circulating human CD34+cell identifies a population of functional endothelial precursors[J]. Blood,2000,95(3):952-958.

[5] Lam CF,Roan JN,Lee CH,et a1. Transplantation of endothelial progenitor cells improves pulmonary endothelial function and gas exchange In rabbits with endotoxin-induced acute lung injury[J]. Anesth Analg,2011,112(3):620-627.

[6] Cao JP,He XY,Xu HT,et al. Autologous transplantation of Perlpheral b1ood-derived circulating endothelial progenitor cells attenuates endotoxin-induced acute lung injury in rabbits by direct endothelial repair and indirect immunomoduluation[J]. Anesthesiology,2012,116(6):1278-1287.

[7] Lam CF,Liu YC，Hsu JK，et al．Autologous transplantation of endothelial progenitor cells attenuates acute lung injury in rabbits[J]. Anesthesiology,2008,108(3):392-401.

[8] Matthay MA,Idell S. Update on acute lung injury and critical care medicine 2009[J]. Am J Respir Crit Care Med,2010,181(10):1027-1032.

[9] Knuefermann P,Baumgarten G,Koch A. CpG olligonucleotide activates Toll-like receptor 9 and causes lung inflammation in vivo[J]. Respir Res,2007,8:72-78.[10] Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al. Isolation of putative Progenitor endothelial cells for angiogenesis[J]. Science,1997,275(5302):964-967.

(本文编辑:张辉)

Anti-inflammatory effect of endothelial progenitor cells transplantation in rats with acute lung injury

LiHui,SuWei,XuDonglin,FuYonghong,ChenWeiming,ZhouHui,YangZili*

(DepartmentofCriticalCareMedicine,GuangzhouFirstMunicipalPeople’sHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180,China)

*Correspondingauthor:Email:yangzilil8888@163.com

Objective:To investigate the anti-inflammatory effect of endothelial progenitor cells (EPCs) transplantation in rats with acute lung injury. Methods: Sixty male SD rats were randomly divided into the control group,ALI group and EPC group (n=20 each).The ALI group and EPC group were treated with LPS (5 mg/kg) intravenously to prepare ALI model. The EPC group was given cell suspension transplantation at half an hour after successful modeling. The changes of serum TNF-α,IL-1β,IL-6 and IL-10 levels,wet-to-dry lung weight (W/D)ratio,TLR9 expression and NF-κB activity during the intervention were determined in the three groups. Results: The serum TNF-α,IL-1β,IL-6,and IL-10 levels in the ALI group and EPC group were significantly increased (P<0.05). At 7 d after modeling,the expression of TLR9 and the activity of NF-κB in the EPC group were significantly lower than those in the ALI group (P<0.05),and the serumTNF-α,IL-1β and IL-6 levels inthe EPC group were also lower than those in the ALI group (P<0.05). Conclusion: EPCs transplantation can relieve inflammatory reaction in rats with acute lung injury with anti-inflammatory effect.

endothelial progenitor cells transplantation; acute lung injury; rats; cytokine

10.3969/j.issn.2095-9664.2016.05.03

广州市科技攻关项目(201300000196)

*通讯作者：Email:yangzilil8888@163.com

R563，Q813.3

A

2095-9664(2016)05-0015-03

2016-08-15)