以脑能量转运蛋白为靶点研究通络醒脑泡腾片的抗痴呆作用*

付文君，胡 勇，任香怡，魏江平，付 昆，徐世军△

(1.四川省中药资源系统研究与开发利用国家重点实验室培育基地，成都 611137; 2.成都中医药大学，成都 611137)

以脑能量转运蛋白为靶点研究通络醒脑泡腾片的抗痴呆作用*

付文君1，2，胡 勇1，2，任香怡1，2，魏江平1，2，付 昆1，2，徐世军1，2△

(1.四川省中药资源系统研究与开发利用国家重点实验室培育基地，成都 611137; 2.成都中医药大学，成都 611137)

目的:通过考察通络醒脑泡腾片干预后MID模型大鼠海马主要能量转运蛋白表达揭示其抗痴呆的作用机制。方法:建立微血栓诱发的MID大鼠模型，给予通络醒脑泡腾片干预90 d，采用Morris水迷宫评价大鼠的学习记忆功能，采用免疫组化和图像分析法评价大鼠海马GLUT-1、MCT-1和MCT-2的表达。结果:与模型对照组比较，通络醒脑泡腾片能显著缩短MID模型大鼠的逃避潜伏期，增加进入有效区域次数并延长有效区域停留时间，差异有统计学意义;通络醒脑泡腾片能显著促进模型大鼠海马GLUT-1、MCT-1和MCT-2表达。结论:通络醒脑泡腾片改善MID模型大鼠学习记忆功能的作用与其促进增强海马能量转运蛋白GLUT-1、MCT-1和MCT-2的表达有关。

通络醒脑泡腾片;多发脑梗死性痴呆;葡萄糖转运体-1;单羧酸转运体-1;单羧酸转运体-2

脑能量代谢障碍在阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，AD)的发病中具有极其重要的地位和作用［1-2］，且日益受到关注和重视。课题组前期提出，老年痴呆是一种脑能量代谢障碍启动的神经退行性疾病，脑能量代谢障碍贯穿于AD整个病程中，并发现Aβ海马注射和双侧颈总动脉永久结扎2种AD模型大鼠海马中丙酮酸脱氢酶(PDH)和α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDHC)活性显著低下，表明该模型存在脑能量代谢障碍［3-4］。已知脑内能量的来源主要是葡萄糖和糖原分解产物乳酸，其中星形胶质细胞可以通过内皮细胞从血液中摄取葡萄糖，进而可将能量代谢底物运送至神经元［5-6］。葡萄糖转运体-1 (Glucose Transporter-1，GLUT-1)、单羧酸转运体-1 (Monocarboxylate Transporter-1，MCT-1)、单羧酸转运体-2(Monocarboxylate Transporter-2，MCT-2)是能量底物转运的关键蛋白，也是胶质细胞和神经元之间实现能量转运的重要纽带，其表达也间接反映脑能量水平的高低［7-8］。前期实验研究发现，通络醒脑泡腾片能改善东莨菪碱致痴呆小鼠模型、Aβ海马注射大鼠模型和双侧颈总动脉永久结扎模型的学习记忆功能，其作用与促进细胞色素C氧化酶、PDH和α-KGDHC等环节有关［4，9］，表明通络醒脑泡腾片具有改善痴呆模型脑能量代谢的作用，但其是否通过上述转运体而发挥作用尚不清楚。为揭示其改善脑能量代谢的可能机制，本研究采用多发脑梗死性痴呆(multi-infarct dementia，MID)模型进行探讨。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠80只，体质量280～320 g，由成都达硕实验动物有限公司提供(实验动物合格证SCXK(川)2013-24)。

1.2 药物与试剂

通络醒脑泡腾片(1.2 g/片，含4.5 g原生药/片)由四川同道堂药业集团股份有限公司提供(批号20140215);甲磺酸双氢麦角毒碱片(喜得镇)，天津华津制药有限公司(批号3H878T);单羧酸转运蛋白-1抗体(MCT-1)兔多克隆抗体(批号 bs-10249R)、单羧酸转运蛋白-2抗体(MCT-2)兔多克隆抗体(批号bs-3995R)、葡萄糖转运蛋白-1抗体(GLUT-1)、兔多克隆抗体(批号bs-4855R)，均由北京博奥森生物技术有限公司提供;二抗和DAB显色试剂盒由北京中山金桥生物有限公司提供。

1.3 主要仪器

WMT-100 Morris水迷宫、Y迷宫，成都泰盟科技有限公司;BA200 Digital数码三目摄像显微系统，麦克奥迪实业集团有限公司;Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，美国Media Cybernetics公司。

2 方法

2.1 造模分组及行为测定

表1显示，采用微血栓栓塞法制备MID大鼠模型［10］。大鼠麻醉后暴露左侧颈动脉，分离出颈外动脉，从总动脉“Y”型分岔处缓慢注入0.4 ml含血栓的生理盐水混悬液，注射后结扎颈外动脉近心端。假手术组动物注射生理盐水，其余步骤与模型动物相同。造模后连续3 d肌注硫酸庆大霉素(0.1 ml/ 100 g)，10 d后采用“Y”迷宫［12］选取MID的模型(错误次数≥6)大鼠50只，随机分成模型对照组、喜得镇组(0.7 mg/kg)、通络醒脑泡腾片高、中、低(7.56、3.78、1.89 g/kg)5组各10只，另随机取10只注射生理盐水的大鼠作为假手术组共6组;10 ml/kg灌胃给予相应药物，连续90 d，每日1次。给药第86天时进行Morris水迷宫实验［11］，连续5 d，末次给药后1 h测定大鼠逃避潜伏期、有效区域进入次数及有效区域停留时间，评价大鼠学习记忆水平。

2.2 免疫组化法测定相关蛋白含量

Morris实验结束后24 h麻醉大鼠，4%多聚甲醛灌注固定，冰上取脑，石蜡包埋、切片，采用免疫组化SP法测定GLUT-1、MCT-1、MCT-2蛋白含量。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统进行图像分析，并测定平均光密度(IA)。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 通络醒脑泡腾片对MID模型大鼠学习记忆功能的影响

与模型对照组比较，通络醒脑泡腾片高、中、低3个剂量组大鼠的逃避潜伏期均显著缩短，低剂量组进入有效区域的次数显著增多，进入有效区域的停留时间显著延长，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 通络醒脑泡腾片对MID模型大鼠学习记忆功能的影响(±s)

表1 通络醒脑泡腾片对MID模型大鼠学习记忆功能的影响(±s)

注:与假手术组比较:#P＜0.05;与模型对照组比较:*P＜0.05

组别 鼠数 剂量g/kg 逃避潜伏期(s) 有效区域进入次数(次) 有效区域停留时间(s)假 手 术 组 10 —11.40± 9.89 6.60±1.35 3.96±1.45模 型 对 照 组 10 — 72.06±47.12# 3.10±3.11# 1.60±1.95#喜 得 镇 组 10 0.7mg 24.57±34.69* 6.30±2.87* 3.32±1.53*通 络醒脑高剂量 组 10 7.56 50.87±39.37* 3.80±2.82 2.61±1.53通 络醒脑中剂量 组 10 3.78 52.14±51.37* 5.00±4.90 2.79±2.39通 络醒脑低剂量 组 10 1.89 29.81±28.85* 6.33±2.50* 3.46±1.71*

3.2 通络醒脑泡腾片对模型大鼠海马GLUT-1、MCT-1和MCT-2表达的影响

3.2.1 通络醒脑泡腾片对 MID大鼠海马GLUT-1蛋白表达的影响 GLUT-1阳性表达为浅黄色或棕黄色，主要表达于细胞浆、细胞膜(图1A)。图1显示，与假手术组比较，模型对照组海马GLUT-1表达减少(P＜0.05);与模型对照组比较，通络醒脑泡腾片高、中剂量组GLUT-1表达显著增高(P＜0.05)。

3.2.2 通络醒脑泡腾片对 MID大鼠海马MCT-1/MCT-2表达的影响 MCT-1、MCT-2主要表达于细胞浆、细胞膜，阳性表达为浅黄色或棕黄色(图2A和图3A)。图2、3显示，与假手术组比较，模型对照组大鼠 MCT-1、MCT-2表达降低(P＜0.05);与模型对照组比较，通络醒脑泡腾片3个剂量组的MCT-1表达明显增强(P＜0.05)，但MCT-2仅高剂量组较模型对照组显著升高(P＜0.05)。

3 讨论

图1 通络醒脑泡腾片对MID大鼠海马GLUT-1表达的影响(×400)

图2 通络醒脑泡腾片对MID大鼠海马MCT-1表达的影响(×400)

AD的脑能量代谢下降首先出现于与记忆相关的脑区，如海马和内嗅皮层［12］，脑能量代谢主要涉及能量底物的运输及细胞内的氧化代谢，而脑的必须和主要的能量代谢底物就是葡萄糖［13］。由于脑组织无法自身合成葡萄糖，因此葡萄糖的转运在脑能量的供应中居于关键地位。星形胶质细胞在脑能量转运中扮演着从血液中吸收葡萄糖并将能量代谢底物运送给神经元的角色。众所周知，ATP是能量的直接来源，三羧酸循环(TCA)是产生ATP的主要方式。丙酮酸作为TCA的中间产物，当脑缺血缺氧状态下，乳酸可经乳酸脱氢酶-1(LDH-1)催化生成丙酮酸，丙酮酸进入TCA后合成ATP，促进脑缺血损伤的快速修复［14］。在AD病理状态下，GLUT1和GLUT3对于葡萄糖的运输发挥着重要作用［15］。当脑内葡萄糖降低时，储存于星形胶质细胞的糖原被分解为乳酸，乳酸作为神经元的功能物质以维持神经元的代谢［16-17］。大鼠脑缺血模型证明，脑缺血后乳酸成为主要的能量底物，加速修复缺血导致的神经元损伤［18］，并在乳酸和葡萄糖同时存在时，神经元更倾向于代谢乳酸［19］。但脑中的乳酸不能直接从血液中获取，其来源于GLUT-1加速葡萄糖透过血脑屏障并经GLUT-3转运至神经胶质细胞，然后在LDH-5催化下生成［20］。生成的脑乳酸经MCT-1/ MCT-4释放到细胞间隙中，再经MCT-2摄取至神经元后由LDH-1催化成丙酮酸参与TCA供能［21］。

图3 通络醒脑泡腾片对MID大鼠海马MCT-2表达的影响(×400)

本次研究结果表明，MID模型大鼠逃避潜伏期显著延长，空间探索功能有障碍(有效区域进入次数减少，有效区域停留时间缩短)，而海马GLUT-1、MCT-1和MCT-2蛋白表达亦明显减少。通络醒脑泡腾片干预后，模型大鼠的逃避潜伏期缩短，有效区域进入次数增多和停留时间延长，且海马中GLUT-1、MCT-1和MCT-2的表达也显著增高。上述研究结果与MCAO大鼠模型文献［22-23］报道结果不一致。文献认为，MCAO大鼠脑组织中GLUT-1、MCTs表达明显增强，并认为可能与动物的代偿反应有关，高表达的GLUT-1、MCTs能够通过提高脑能量转运缓解缺血所造成的能量供应不足［13-14］。造成结果不一致的原因，一是该文献有再灌注损伤过程，提示脑缺血再灌注损伤后脑组织病理修复机制可能与多发性脑腔梗不同;二是本研究造模后持续给药干预时间达3个月，病理损伤已经为失代偿期，长时间脑缺血损伤后仅依靠乳酸代谢产能可能无法维持大脑高耗能体系的运转，当脑内能量逐步耗竭，能量底物转运相关基因无法表达，蛋白质合成受阻［1，24］，导致其表达降低，具体原因有待进一步的深入研究。

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Anti Dementia Effects of Tongluo Xingnao Effervescent Tablet With the Target of Brain Energy Transporter

FU Wen-jun1，2，HU Yong1，2，REN Xiang-yi1，2，WEI Jiang-pin1，2，FU Kun1，2，XU Shi-jun1，2△
(1.Sichuan Provincial Key Laboratory，Systematic Research and Development of Chinese Medicinal Resources，Province-Ministry Co-constructed State Key Lab Incubation Base，Chengdu 611137，China; 2.Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China)

Objective:To study the effect of Tongluoxingnao effervescent tablet(TLXNET)on the expression of energy transport-related proteins in multi-infarct dementia(MID)rats in order to explore its mechanism of anti-dementia.Methods:Microthrombus was used to establish MID model rats which were intervened by gastric infusion of TLXNET for 90 d.Evalneting the learning and memory ability of MID model rats via Morris water maze.Additionally the expressions of GLUT-1，MCT-1 and MCT-2 in hippocampal were measured by immunohistochemical and image analysis.Results: Compared with the model control group，TLXNET could significantly reduce the escape latency，increase times of entrance into the valid region and prolong the residence time of MID model rats，which all revealed a significant statistic;meanwhile the expressions of GLUT-1，MCT-1 and MCT-2 were notably raised after administration of TLXNET，with an increase in the average optical density.Conclusion:TLXNET can improve learning and memory deficit which is related with promoting the expression of energy metabolism-related proteins transportation such as GLUT-1，MCT-1 and MCT-2.

Tongluoxingnao effervescent tablet;Multi-infarct dementia;GLUT-1;MCT-1;MCT-2

R285.5

B

1006-3250(2016)12-1612-04

2016-05-24

“重大新药创制”科技重大专项(2013ZX09103002-008)-脑络重塑治疗老年痴呆新药—通络醒脑微丸的研究;四川省杰出青年学术技术带头人计划项目(2011JQ0014)-芩芎当归解毒益智方对Aβ代谢的调控及机制研究;成都市产业发展技术支撑计划—高校院所应用基础研究项目(12DXYB321JH-002)-通络醒脑泡腾片抗老年痴呆的代谢组学及改善认知的机构基础研究

付文君(1992-)，女，新疆伊犁人，在读硕士，从事中药神经与精神药理学的临床与研究。

△通讯作者:徐世军(1975-)，男，甘肃静宁人，教授，从事中药神经与精神药理学的临床与研究，Tel:028-61800231，E-mail:docxu@126.com。