菩人丹改善高糖波动状态下INS-1细胞胰岛素分泌功能的分子机制*

白颖慧，杜子亮，陈 书，鲁碧楠，庞宗然Δ

(1.中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，中国少数民族传统医学国家民委-教育部重点实验室，北京 100081;2.北京市回民医院，北京 100053)

菩人丹改善高糖波动状态下INS-1细胞胰岛素分泌功能的分子机制*

白颖慧1，杜子亮2，陈 书1，鲁碧楠1，庞宗然1Δ

(1.中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，中国少数民族传统医学国家民委-教育部重点实验室，北京 100081;2.北京市回民医院，北京 100053)

目的:考察菩人丹改善高糖波动状态下INS-1细胞胰岛素分泌功能的分子机制。方法:将INS-1细胞置于含33.3 mmol ·L－1和11.1 mmol·L－1葡萄糖RPMI1640培养液内12 h交替培养，持续培养5 d构建高糖波动细胞模型。分别以5%、10%菩人丹含药血清对高糖波动状态下INS-1细胞干预24 h，并以二甲双胍含药血清作为阳性对照。正常对照组细胞以含11.1 mmol·L－1葡萄糖的RPMI1640培养液进行培养。采用CCK-8试剂盒检测细胞活力，大鼠胰岛素ELISA试剂盒测定胰岛素分泌量，Western blot分析IRS2、Akt、mTOR、P70s6k和PTP1B的蛋白质表达水平及磷酸化水平。结果:与正常组比较，高糖波动能够显著降低INS-1细胞活力及胰岛素分泌量，下调INS-1细胞的IRS2蛋白质表达水平，提高IRS2磷酸化水平，降低INS-1细胞Akt、mTOR和P70s6k的磷酸化水平，上调PTP1B蛋白质表达水平。与模型组比较，菩人丹含药血清能增加INS-1细胞活力及胰岛素分泌量，上调IRS2蛋白质表达，抑制IRS2磷酸化，促进Akt、mTOR和P70s6k的磷酸化，下调PTP1B蛋白表达水平。结论:菩人丹调控高糖波动诱导的INS-1细胞IRS2、Akt、mTOR、P70s6k和PTP1B的蛋白质表达水平及磷酸化水平，改善高糖波动状态下胰岛β细胞胰岛素分泌功能。

INS-1细胞;高糖波动;胰岛素分泌;菩人丹;IRS2-PI3K/Akt

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的主要病理表现是糖脂代谢紊乱，而血糖水平的急性改变是T2DM患者糖代谢紊乱的重要形式。研究已证实［1-3］，高糖状态下的血糖波动通过激活氧化应激、炎症通路等方式，导致胰岛β细胞数量异常减少和胰岛素分泌功能的下降，致使胰岛β细胞无法分泌足够的胰岛素以调节机体血糖稳态，从而加速T2DM的发生发展。因此，保护高糖波动(fluctuatedhigh glucose，FG)状态下胰岛β细胞功能，是减缓T2DM病程的基础。本实验以大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1细胞为研究对象，体外模拟高糖波动状态下胰岛β细胞分泌功能的变化，考察中药降糖复方菩人丹(Pu Ren Dan，PRD)对胰岛β细胞胰岛素分泌的影响，并以胰岛素受体底物2/磷酸肌醇-3激酶/蛋 白 激 酶 B (insulin receptor substrate 2/ phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，IRS2-PI3K/Akt)信号通路为切入点，探讨菩人丹改善糖波动状态下INS-1细胞胰岛素分泌功能的分子机制。

1 实验材料

1.1 动物及细胞株

大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1细胞株，购自协和医科大学细胞中心;SPF级雄性Wistar大鼠90只，8周龄，体质量300 g左右，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK-军2007-004)。

1.2 主要药品及试剂

人参(亚威中药饮片有限公司)、丹参(金香中药饮片有限公司)、葛根(金香中药饮片有限公司)、制何首乌(亚威中药饮片有限公司)、制水蛭(金香中药饮片有限公司)、苦瓜冻干粉(诺金科生物技术有限公司)、盐酸二甲双胍片(双鹤药业)、Cell Counting Kit-8(CCK-8)(DOJINDO同仁化学研究所)、大鼠胰岛素ELISA试剂盒(RD Biosciences公司)、p-IRS2(ser731)、IRS2、p-Akt(thr308)、p-mTOR (ser2448)、p-P70s6k(thr389)(CellSignaling Technology公司)、PTP1B(Millipore公司)。

1.3 主要仪器

超净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司)，血球计数板(上海求精公司)，多功能酶标仪(美国分子仪器公司)，Bio-Rad电泳仪(美国伯乐仪器有限公司)，水平脱色摇床(江苏其林贝尔仪器有限公司)，湿转电泳槽(北京凯元信瑞仪器有限公司)，Fresco低温冷冻离心机(美国 Thermo Scientific公司)。

1.4 菩人丹含药血清制备

1.4.1 中药菩人丹制备 菩人丹降糖方由苦瓜、人参、丹参、制首乌、葛根及水蛭组成。将人参、丹参、制首乌、葛根及水蛭以冷水浸泡过夜后，加8倍水回流提取2次，时间为1.5、1 h，其中人参单独提取，余药材一并提取，收集提取液过滤后合并，于旋转蒸发仪中浓缩。取苦瓜冻干粉加入之前药材浓缩液中，蒸馏水补齐，制备浓度相当于生药量7.21 g ·mL－1的菩人丹。

1.4.2 菩人丹含药血清制备 取SPF级雄性Wistar大鼠90只，8周龄，体质量(300 g±10 g)，大鼠适应性喂养1周后，将大鼠按随机数字表法分为3组，即菩人丹组30只，二甲双胍阳性对照组30只和空白对照组30只，各组均饲以普通维持饲料。根据前期研究结果［8-13］，确定大鼠给药体质量剂量为正常给药剂量的10倍，即菩人丹组以144.2 g(生药)·kg－1·d－1水煎液灌胃，二甲双胍阳性对照组以1.4 g·kg－1·d－1的二甲双胍0.5%CMC-Na乳浊液灌胃;空白对照组以0.5%CMC-Na溶液灌胃。各组大鼠的灌胃体积为10 mL·kg(体质量)－1，每日给药2次(间隔12 h)，连续给药5 d。第5天首次给药(即第9次给药)后1 h，腹腔注射10%水合氯醛(体质量剂量3 mL·kg－1)麻醉大鼠，腹主动脉取血，血样室温静置3 h，3500 rpm离心15 min取上清，分别将各组大鼠血清混合，56℃水浴灭活30 min，一次性无菌微孔滤膜(0.22 μm)过滤灭菌，分装后－80℃保存备用。

2 实验方法

2.1 细胞培养

INS-1细胞在完全RPMI1640培养液(含10%胎牛血清，葡萄糖11.1 mmol·L－1，1 mmol·L－1丙酮酸钠，2 mmol·L－1L-谷氨酰胺，10 mmol·L－1HEPES，50 μmol·L－1β-巯基乙醇，100 kU/L青霉素，100 mg/L链霉素)中培养，每3 d更换1次培养基，待细胞处于对数生长期后予以传代。

2.2 模型复制及分组

取同代 INS-1细胞置于含33.3 mmol·L－1和11.1 mmol·L－1葡萄糖的RPMI1640培养液内12 h交替培养，持续培养5 d。将INS-1细胞等密度接种于培养板中，待细胞完全贴壁后随机分组并进行干预:正常对照组(Control组，常规 RPMI1640中培养)、高糖波动模型组(FG组，高糖RPMI1640培养液与常规RPMI1640中交替培养5 d，每12 h交替，后以常规RPMI1640培养24 h)、菩人丹药物血清高剂量组(H-PRD组，FG组细胞中加入终浓度10%的菩人丹含药血清常规RPMI1640培养液干预24 h)、菩人丹药物血清低剂量组(L-PRD组，FG组细胞中加入终浓度5%的菩人丹含药血清常规RPMI1640培养液干预24 h)、二甲双胍药物血清对照组(MF组，FG组细胞中加入终浓度10%的二甲双胍含药血清培养液干预24 h)。

2.3 细胞活力检测

收集对数生长期的INS-1细胞，将细胞浓度调整至1×105cells·mL－1并接种于96孔板，每孔200 μL，于5%CO2、37℃恒温湿化培养箱中培养。各组细胞干预结束后按照CCK-8试剂盒说明书操作，酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)，以Control组A为对照，按照干预组A/正常组A×100%计算各组细胞活力。

2.4 葡萄糖刺激的胰岛素释放实验

将INS-1细胞按2×105/孔的密度接种于24孔板中培养到80%～90%融合，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2遍后，加入含有3 mmol·L－1葡萄糖的Krebs-Ringer HEPES缓冲液(KRBH缓冲液，含有 115 mmol·L－1氯化钠，24 mmol·L－1碳酸氢钠，5 mmol· L－1氯化钾，1 mmol·L－1氯化镁，25 mmol·L－1HEPES，0.5%BSA，pH 7.4)，在37℃下平衡20 min弃去上清，分别加入含3 mmol·L－1或20 mmol·L－1葡萄糖的KRHB缓冲液，37℃孵育20 min，小心吸取上清液(注意尽量不要吸到细胞)后4℃离心800 rpm，5 min，收集上清后采用ELISA法测定胰岛素分泌量。相应的细胞加200 μL细胞裂解液，BCA法测每组细胞总蛋白含量。每组实验均设复孔，重复3次。通过总蛋白含量对胰岛素释放量进行校正，计算出各组细胞的基础胰岛素分泌(basal insulin secretion，BIS)和葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)。

2.5 Western blot分析

利用western blot分析检测胰岛素受体底物2 (insulin receptor substrate 2，IRS2)、蛋白激酶 B (protein kinase B，Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、40S核糖体S6蛋白激酶(P70 ribosomal protein S6 kinases，P70s6k)和蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)的蛋白质表达水平及磷酸化水平。收集各组细胞，按RIPA蛋白抽提试剂盒说明抽取各组细胞总蛋白，用BCA法检测蛋白质浓度。制备蛋白样品转膜、封闭，置于一抗(p-IRS2 (ser731)1∶1000、IRS 1∶1000、p-Akt(thr308)1∶1000、p-mTOR(ser2448)1∶2000、p-P70s6k(thr389)1∶1000、PTP1B 1∶4000)中4℃过夜，次日置于二抗(1∶20000)中，摇床上室温孵育40 min，ECL发光显色，Bio-Rad图像分析系统对Western印迹目的条带进行扫描，然后用Quantity One软件分析目的条带光密度值与内参条带光密度值的比值来评估结果。

2.6 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，正态分布资料以均数±标准差(±s)表示，2组间比较采用两样本均数的t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 菩人丹对高糖波动状态下INS-1细胞的活力检测

图1显示，采用CCK-8试剂盒测定细胞活力，结果显示INS-1细胞在含33.3 mmol·L－1葡萄糖的培养液和含11.1 mmol·L－1葡萄糖的培养液中培养5 d后，细胞活力显著降低，以常规培养液培养的INS-1细胞(细胞活力为100%)为对照，FG组细胞活力下降至(57.40% ±5.32%，P＜0.001)。分别给予低剂量(5%)和高剂量(10%)菩人丹含药血清对高糖波动损伤INS-1细胞进行24 h干预，结果LPRD组与FG组的细胞活力比较差异无统计学意义(60.40%±3.58%，P=0.275)，但H-PRD组作用24 h后，INS-1细胞活力较 FG组细胞明显升高(80.00%±4.12%，P＜0.001)。

图1 菩人丹对高糖波动状态下INS-1细胞的活力检测注:与FG组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

3.2 菩人丹对高糖波动状态下INS-1胰岛素分泌功能的影响

图2显示，利用ELISA方法对INS-1细胞的胰岛素分泌量进行检测。实验结果显示，与正常对照组比较，INS-1细胞的基础胰岛素分泌量(BIS)由(0.77±0.07)μU/mg/h下降至(0.522±0.065) μU/mg/h(P＜0.001)，葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)则由(1.908±0.085)μU/mg/h降低至(0.61±0.117)μU/mg/h(P＜0.001);低剂量菩人丹干预24 h后，INS-1细胞的BIS与FG组比较无明显改变，但GSIS显著升高(0.826±0.065 μU/mg/ h，P=0.009);高剂量即菩人丹可以明显增加INS-1细胞的胰岛素分泌量，BIS增加至(0.692±0.006) μU/mg/h(P＜0.001)，GSIS增加至(1.21±0.123) μU/mg/h(P＜0.001)。

图2 菩人丹对高糖波动状态下INS-1细胞胰岛素分泌功能的影响注:与FG组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

3.3 菩人丹对INS-1细胞IRS2、Akt、mTOR、P70s6k和PTP1B的蛋白质表达水平及磷酸化水平的影响

3.3.1 菩人丹对高糖波动状态下INS-1细胞IRS2蛋白质表达及磷酸化的影响 图3显示，与Control组比较，FG组INS-1细胞的IRS2蛋白质表达水平明显下调(63.00% ±4%，P＜0.001)，菩人丹则能显著上调高糖波动状态下损伤INS-1细胞的IRS2蛋白质表达水平，菩人丹干预组细胞的IRS2蛋白质表达水平与FG组比较升高(86.00%±4%，P＜0.001);与Control组比较，FG组IRS2(ser731)磷酸化水平升高(318.00% ±18%，P＜0.001)，菩人丹作用24 h后，损伤INS-1细胞IRS2(ser731)磷酸化水平显著降低(72.00%±3%，P＜0.001)。

图3 菩人丹对高糖波动状态下INS-1细胞IRS2蛋白质表达及ser731位点磷酸化的影响注:与FG组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

图4 菩人丹对高糖波动状态下INS-1细胞Akt(thr308)磷酸化的影响注:与FG组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

图5 菩人丹对高糖波动状态下INS-1细胞mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)磷酸化的影响注:与FG组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

图6 菩人丹对高糖波动状态下INS-1细胞PTP1B蛋白表达水平的影响注:与FG组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

3.3.2 菩人丹对高糖波动状态下INS-1细胞Akt(thr308)磷酸化的影响 图4显示，高糖波动状态下Akt苏氨酸308位点磷酸化水平明显降低，与Control组比较，FG组Akt(thr308)磷酸化水平下降(62%±2%，P＜0.001)。菩人丹可上调INS-1细胞Akt(thr308)磷酸化水平，促进Akt活化。菩人丹作用24 h后，FG损伤细胞的Akt(thr308)磷酸化水平升高(70%±1%)。

3.3.3 菩人丹对高糖波动状态下INS-1细胞mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)磷酸化的影响图5显示，高糖波动状态下 INS-1细胞 mTOR (ser2448)的磷酸化水平显著下降，FG组 mTOR (ser2448)磷酸化水平较 Control组下降(30% ± 5%，P＜0.001)，菩人丹作用24 h后，INS-1细胞mTOR(ser2448)磷酸化水平上调(48%±8%，P= 0.006)。作为mTOR效应因子的P70s6k，其thr389位点的磷酸化在高糖波动状态下被显著抑制;与Control组比较，FG组P70s6k(thr389)磷酸化水平下降(14%±4%，P＜0.001)，菩人丹作用24 h后，FG组细胞 P70s6k(thr389)磷酸化水平均显著升高(58%±6%，P＜0.001)。

3.3.4 菩人丹对高糖波动状态下INS-1细胞PTP1B蛋白质表达的影响 图6显示，高糖波动状态下，INS-1细胞的PTP1B蛋白质表达显著上调，与control组比较，FG组 PTP1B蛋白质表达水平(126%±8%，P=0.002)，菩人丹作用24 h后，FG损伤细胞PTP1B蛋白表达水平下调(64%±10%，P＜0.001)。

4 讨论

血糖波动不仅是糖尿病慢性并发症重要的独立危险因素，而且与胰岛β细胞功能密切相关。研究发现，血糖水平波动较大时β细胞功能减低明显高于较小的血糖水平波动，提示胰岛β细胞功能损害的严重程度与血糖波动幅度的大小有关。邱平等［10］通过体外实验证明，波动性高糖可显著降低细胞的GSIS，并推测其机制可能涉及线粒体氧化应激损伤。课题组前期研究也证实了波动性高糖对胰岛β细胞的损伤作用［6］。

IRS2是维护胰岛β细胞功能的关键信号蛋白。Hennige等［11］发现，小鼠β细胞内IRS2表达增加可以促进β细胞生长、存活和改善其胰岛素分泌功能。本实验发现，高糖波动状态下INS-1细胞的IRS2蛋白表达水平显著降低，这可能是与高糖波动状态下IRS2的异常降解有关。同时我们发现，IRS2丝氨酸731位点磷酸化水平却明显增高，这可能是由于高糖波动状态抑制蛋白酪氨酸激酶的活化，而菩人丹干预后INS-1细胞的IRS2蛋白质表达水平明显升高，IRS2丝氨酸731位点磷酸化水平明显下降，说明菩人丹能有效抑制IRS2蛋白降解和IRS2蛋白731位点丝氨酸磷酸化，从而修复高糖波动状态下INS-1细胞的胰岛素信号传导障碍。

AKT分子通过不同的下游底物调节胰岛β细胞大小、数量、细胞内的基因转录以及细胞分泌功能［12］。本实验发现，在高糖波动状态下Akt苏氨酸308位点磷酸化水平明显降低，进而使INS-1细胞胰岛素分泌功能下降。

mTOR是磷脂酰肌醇相关蛋白激酶(PIKK)的家族成员，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，可以响应细胞外信号，激活下游效应因子，参与基因转录、蛋白质翻译等过程，以调节β细胞生存、增殖及蛋白质合成。P70s6k是mTOR的下游靶蛋白，是mTOR效应因子中研究最广泛的，P70s6k的Thr389磷酸化被认为是mTOR激活的镜子［13］。本实验观察到，在高糖波动状态下INS-1细胞mTOR和P70s6k活性均受到抑制，mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)磷酸化水平均显著降低。而菩人丹干预后，mTOR和P70s6k的磷酸化水平均明显升高，提示菩人丹可通过促进 Akt和 mTOR的磷酸化水平进而活化P70s6k，使细胞总体蛋白质翻译水平升高，从而促进INS-1细胞的增殖。

PTP1B可在胰岛素信号级联中的多个位点发挥负调控作用，过度表达PTP1B能增加胰岛素受体、胰岛素受体底物的脱磷酸化，并下调受体后信号，从而引起胰岛素信号传导障碍并引发胰岛素抵抗甚至T2DM。研究表明［14］，敲除PTP1B基因后，小鼠胰岛素敏感性显著增强，即使在高脂高热卡饮食环境下，小鼠也不出现肥胖或胰岛素抵抗，若重新表达PTP1B，原本增强的胰岛素敏感性则会出现显著减弱。本实验证实，在高糖波动状态下，INS-1细胞PTP1B蛋白质表达水平显著上调，而菩人丹干预后细胞PTP1B蛋白质表达水平下降，说明菩人丹部分抑制PTP1B对胰岛素信号传导的负性调控，从而改善INS-1细胞IRS2/PI3K/Akt信号传导。

前期研究表明，菩人丹具有降糖、调脂、减轻胰岛素抵抗、抑制胰岛β细胞凋亡、保护胰岛β细胞功能的作用［4-9］。本实验在此基础上，进一步考察了菩人丹对高糖波动胰岛β细胞胰岛素分泌功能的影响，揭示了菩人丹通过调控IRS2/PI3K/Akt信号通路中IRS2、Akt、mTOR/P70s6k和PTP1B蛋白质表达水平及其磷酸化水平，改善胰岛β细胞分泌功能的分子机制，为菩人丹修复胰岛β细胞损伤，防治T2DM的临床应用提供了实验依据。

［1］HOU，Li HL，ZHAO JJ，et al.Impairment of pancreatic islet beta cell function induced by intermittent high glucose through oxidative and endoplasmic reticulum stress:experiment with rat pancreatic islet beta cells［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88(28):2002-2004.

［2］ SYEDA K，MOHAMMED A M，ARORA D K，et al.Glucotoxic conditions induce endoplasmic reticulum stress to cause caspase 3 mediated lamin B degradation in pancreatic beta-cells:protection by nifedipine［J］.Biochem Pharmacol，2013，86(9):1338-1346.

［3］KIM M，CHUNG H，YOON C，et al.Increase of INS-1 cell apoptosis under glucose fluctuation and the involvement of FOXOSIRT pathway［J］.Diabetes Res Clin Pract，2012，98(1):132-139.

［4］庞宗然，赵玉堂，李静华，等.菩人丹超微粉对肥胖型2型糖尿病大鼠糖代谢相关指标的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16(5):107-110.

［5］金英，鲁碧楠，刘祖涵，等.菩人丹对T2DM大鼠胰岛β细胞分泌功能及胰岛素敏感性的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2012，18(10):1090-1092.

［6］鲁碧楠.菩人丹对糖脂毒导致的INS-1细胞损伤的修复作用及机制研究［D］.北京:中央民族大学，2013.

［7］杜子亮，鲁碧楠，陈书，等.菩人丹对高糖诱导的INS-1细胞凋亡、BAD和FOXO1蛋白表达的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(22):173-177.

［8］ 陈书，鲁碧楠，杜子亮，等.菩人丹调控IRS2、BAD、FOXO1蛋白表达和磷酸化抑制INS-1细胞凋亡的分子机制［J］.中国中医基础医学杂志，2013，19(11):1341-1344.

［9］鲁碧楠，苏占辉，苏晓慧，等.菩人丹超微粉对T2DM大血管损伤大鼠骨骼肌IRS-1，GLUT-4，PI-3K，NF-κB蛋白表达的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(9):210-214.

［10］邱平，赵铁耘，李秀钧，等.间断高浓度葡萄糖对胰岛β细胞的损伤机制研究［J］.四川大学学报:医学版，2008，39 (6):69-71，93.

［11］ HENNIGE A M，SARTORIUS T，TSCHRITTER O， et al.Tissue selectivity ofinsulin detemiraction in vivo［J］.Diabetologia，2006，49(6):1274-1282.

［12］MIAO X Y，GU Z Y，LIU P，et al.The human glucagon-like peptide-1 analogue liraglutide regulatespancreatic beta-cell proliferation and apoptosis via an AMPK/mTOR/P70S6K signaling pathway［J］.Peptides，2013，39:71-79.

［13］李小明，杨作成，陈淳媛，等.mTOR/p70S6K信号通路与NIH3T3成纤维细胞增殖［J］.现代预防医学，2008，35 (18):3582-3584.

［14］PANZHINSKIY E，REN J，NAIR S. Protein tyrosine

phosphatase 1B and insulin resistance:role of endoplasmic reticulum stress/reactive oxygen species/nuclear factor kappa B axis［J］.PLoS One，2013，8(10):e77228.

Purendan Improving the Molecular Mechanism of Ins-1 Cell Insulin Secretion under High Glucose Fluctuation

BAI Ying-hui1，DU Zi-liang2，CHEN Shu1，LU Bi-nan1，PANG Zong-ran1Δ
(1.Institute of Chinese Minority Traditional Medicine，Mizu University of China.Key Laboratory for Chinese Minority Traditional Medicine of Ministry of Education，Beijing 100081，China;2.The Moslem Hospital of Bejing，Beijing 100053，China)

Objective:To study the molecular mechanism of Pu Ren Dan improving the secretion function of INS-1 cell under fluctuated high glucose.Methods:INS-1 cell was cultured in high glucose RPMI1640 medium containing 33.3 mmol ·L－1glucose and conventional RPMI1640 medium containing 11.1 mmol·L－1glucose each 12 hours for 5 days to induce fluctuated high glucose cell model.INS-1 cell was intervened in 5%and 10%drug serum containing PRD for 24 hours as PRD experimental group，drug serum containing Metformin as the positive control group.The INS-1 cell in the normal control group was cultured in RPMI1640 medium containing 11.1 mmol·L－1glucose.Using CCK-8 kit to detect cell viability，ELISA to test the insulin secretion of INS-1 cell，Western blot assay to test proteins expression and phosphorylation levels of IRS2，Akt，mTOR，P70s6k，PTP1B.Results:Compared with the control group，cell viability and insulin secretion level of INS-1 cell in FG decreased significantly.Protein expression level of IRS2 decreased，phosphorylation of IRS-2 increased;phosphorylations of Akt，mTOR and P70s6k lowered significantly;while the protein expression level of PTP1B increased.Compared with the model group，cell viability and insulin secretion level of INS-1 cell in PRD experimental group increased significantly.Protein expression level of IRS2 increased，phosphorylation of IRS2 lowered;phosphorylations of Akt，mTOR and P70s6k increased significantly;while the protein expression level of PTP1B decreased.Conclusion:Pu Ren Dan regulates the protein expression and phosphorylation levels of IRS2，Akt，mTOR，P70s6k and PTP1B of INS-1 cell induced by fluctuated high glucose，improving the insulin secretion function of INS-1 cell under fluctuated high glucose.

INS-1 cell;Fluctuated High Glucose;Insulin secretion;Pu Ren Dan;IRS2-PI3K/Akt

R285.5

B

1006-3250(2016)12-1620-05

2016-05-27

国家自然科学基金资助项目(81072963)-菩人丹超微粉调控PTP1B蛋白与IRS2/PI3K/Akt信号转导改善胰岛β细胞形态与功能的作用机制;国家自然科学基金青年基金项目(81302946)-基于IR信号转导系统的菩人丹修管T2DM胰岛β细胞损伤作用靶点研究

白颖慧(1991-)，女，河南新密人，在读硕士，从事2型糖尿病发病机制及其传统医药干预研究。

△通讯作者:庞宗然(1966-)，男，研究员，博士研究生导师，从事糖尿病及其并发症发病机制与中医药干预研究，Tel: 010-68935090，E-mail:zrpang@163.com。