木瓜蛋白酶对黑啤浑浊的影响研究

丁海涛，　杨　红，　徐佩琳，　张　洁，　邹　乐

(1.合肥学院 生物与环境工程系，合肥　230601；2.合肥学院 计算机科学与技术系，合肥　230601)



木瓜蛋白酶对黑啤浑浊的影响研究

丁海涛1，杨红1，徐佩琳1，张洁1，邹乐2

(1.合肥学院 生物与环境工程系，合肥230601；2.合肥学院 计算机科学与技术系，合肥230601)

摘要：为降低黑啤浑浊度，同时尽可能保留营养成分，向黑啤中添加木瓜蛋白酶分解蛋白质。选取酶处理温度、处理时间、酶浓度作为影响因子，分析其对黑啤浑浊的影响。在单因素实验结果上进行正交工艺优化。结果表明：向黑啤中添加酶浓度0.12mg/100mL的木瓜蛋白酶，反应温度为50℃，反应12h其浑浊度可降10.80%，啤酒感评可接受，能达到进一步澄清的效果。

关键词：木瓜蛋白酶；黑啤；浑浊

啤酒在生产、运输、销售的过程中由于内部成分和外部环境条件的作用，比如说浑浊活性蛋白与浑浊活性多酚的相互作用、外部条件的氧化、光照等作用都极易出现啤酒沉淀浑浊现象从而导致啤酒品质的下降。[1]目前研究结果显示造成啤酒浑浊主要有两大方面因素的影响，一方面是生物浑浊，另一方面是非生物浑浊。[2]

引起啤酒非生物浑浊的主要因素之一就是蛋白质和多酚之间的相互作用，二者的相互作用同时也是影响啤酒的泡沫覆盖率、泡持性、口感、味道等啤酒品质的重要因素。[3]啤酒中蛋白质混浊现象大体可分为氧化浑浊、杀菌混浊、冷热混浊三种。[4]浑浊一旦形成即会对啤酒的品质造成危害。木瓜蛋白酶是一种由单肽链组成的蛋白水解酶，能够水解多种蛋白质和多肽。相对分子质量约为22 000，约含有211个氨基酸残基，且这些氨基酸残基中有少许占据于酶的活性中心位置，能够直接与底物分子结合，催化底物化学反应。[5]木瓜蛋白质酶最适合pH 值为5～6(一般2～9皆可), 最适合温度55～65℃(一般25～85℃皆可)，特别适合啤酒生产工艺特定条件。该酶耐热性强，在90℃时也不会完全失活。由于其具有良好的稳定性、较强的水解能力和降解多种蛋白质的能力，现已被广泛应用于嫩化肉类产品、啤酒澄清、豆腐加工等[6-7]，增加泡沫覆盖率，提高啤酒的泡持性，改善口感的同时也能提高啤酒的营养价值[8]。南宁华南公司的研究结果表明在啤酒生产过程中的麦芽蛋白分解阶段、后酵或清酒阶段加入木瓜蛋白酶均能很好地降低啤酒的浑浊度[9]。本研究以合肥学院自酿黑啤为原料，向其中添加木瓜蛋白酶来达到降低其浊度的目的，以提高其在市场上的竞争力。

一、材料与方法

(一)实验材料

黑啤：合肥学院生物与环境工程系啤酒中试线酿造。

(二)仪器及试剂

1.仪器设备

TP-300D型电子天平，湘仪天平仪器设备有限公司；722型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；DKS-28型不锈钢新型电热恒温水浴锅，宁波江南仪器厂；GZX-9070MBE精密鼓风恒温干燥箱，合肥达斯卡特科学器材有限公司；BCD-160TB冰箱，青岛海尔股份有限公司；KQ2200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SS-2Z型智能悬浮物仪，上海海争电子科技有限公司；等。

2.实验试剂

木瓜蛋白酶，食品级，北京澳博星生物技术有限责任公司；考马斯亮蓝G250，分析纯， 国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇，分析纯，山海苏懿化学试剂有限公司；磷酸，分析纯，西陇化工股份有限公司；牛血清白蛋白，化学纯，上海源聚生物科技有限公司；等。

(三)实验方法

1.啤酒中蛋白质含量的测定

考马斯亮蓝染色法[10]

(1)标准曲线的测定。取7支试管，依次加入0.1mg/mL标准蛋白质溶液 0、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1mL，分别加入蒸馏水定容至1.0mL。再向7支试管中分别加入5.0mL考马斯亮蓝G250试剂，边加入边混合摇匀。

加完试剂4分钟左右，于可见分光光度计下测定各样品在595nm处的吸光度，以未加蛋白质溶液的试管作为空白对照，以标准蛋白质质量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标做标准曲线。

(2)样品的测定。用2mL的移液管移取2mL黑啤与烧杯中，同时用10mL移液管移取8mL蒸馏水与烧杯中稀释(稀释5倍)，取1mL蒸馏水作为空白对照，参照1.3.1中的(1)进行操作，在分管光度计中测出其在595nm处的吸光度。

(3)结果的计算。依据所测黑啤酒的吸光度值，在标准曲线上寻出对应的蛋白质质量，按下列公式计算出蛋白质含量(mg/100g)。

(1)

其中：c为曲线中所对应的蛋白质质量，mg；m为啤酒的质量，g。

2.木瓜蛋白酶溶液的配置

用电子天平准确称取定量的木瓜蛋白酶粉末，使用超声波辅助溶解，分别配置成浓度为0.04mg/mL、0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL的酶溶液。

3.啤酒浑浊度的测定

将加热后的啤酒取出，迅速放入冰箱冷却5min后取出。精确量取2mL反应过后的黑啤，加入48mL的水溶液稀释，混合后倒入智能悬浮物仪的玻璃皿中，将玻璃皿放入仪器槽中，盖上黑盖，读取数据。

4.单因素实验设计

(1)木瓜蛋白酶浓度：分别用移液管在上述配置好的不同酶液中量取1mL于100mL的啤酒中，此时酶浓度依次为0.04mg/100mL、0.08mg/100mL、0.12mg/100mL、0.16mg/100mL，空白对照取1mL水溶液，按上述相同步骤进行，同时啤酒与水浴锅中的恒温条件设置为50℃，反应12小时后根据啤酒浑浊度的测定中的步骤进行操作获得啤酒的浑浊度。

(2)反应温度：分别用1mL的移液管量取4份0.12mg/mL的木瓜蛋白酶水溶液于100mL的黑啤中，将水浴锅温度依次设置为40、50、60和70℃，反应12h。根据啤酒浑浊度测定中的步骤进行操作获得啤酒的浑浊度。

(3)处理时间：分别用1mL的移液管量取4份0.12mg/mL的木瓜蛋白酶水溶液与100mL的黑啤中，在水浴锅温度设为50℃的条件下，在该温度条件下分别反应4h、8h、12h、16h。根据啤酒浑浊度的测定中的步骤进行操作获得啤酒的浑浊度。

5.正交实验设计

根据单因素试验结果进行L9(34)优化。因素水平表见表1。

表1　因素水平表

6.啤酒感观评定[11]

表2　浓色啤酒、黑色啤酒感官要求

二、结果与分析

(一)蛋白质标准曲线

将不同浓度的标准蛋白溶液在595nm下测得的吸光度值绘制成标准曲线如图1所示。回归方程为：y=4.9803x+0.0136；R2=0.9919。

图1　蛋白质标准曲线

(二)单因素对啤酒浑浊的影响

1.酶浓度对啤酒浑浊的影响

不同浓度的酶溶液对啤酒浑浊的影响见图2。

图2　酶浓度对啤酒浊度的影响

由图2可知随着木瓜蛋白酶浓度的升高，啤酒的浊度缓慢降低，当酶浓度达到0.12mg/mL时其浊度下降最多，浊度下降11.52%；随着木瓜蛋白酶浓度的进一步增大，浊度下降幅度反而减小。产生这一现象的原因是由于啤酒中蛋白质含量有限，而酶过量会与啤酒中的一些成分发生沉淀反应[12]，导致降浊效果下降。故选取0.08mg/100mL、0.12mg/100mL、0.16mg/100mL作为正交实验中酶浓度因素的三个水平。

2.反应温度对啤酒浑浊的影响

不同酶处理温度对啤酒浑浊的影响见图3。

图3　反应温度对啤酒浊度的影响

由图3可看出，随酶处理温度身高，浊度降低效果逐渐增大，当温度为50℃时，啤酒的浊度降低达到最大，为10.7%；随着处理温度进一步增加，浊度下降效果逐渐减小。这是因为随温度升高，啤酒的含氧量不断增高，啤酒的氧化浑浊现象越发严重。故选取40℃、50℃、60℃作为正交试验中反应温度因素的三个水平。

3.反应时间对啤酒浑浊的影响

不同反应时间对啤酒浑浊的影响见图4。

图4　反应时间对啤酒浊度的影响

由图4可看出随着反应时间的增加，啤酒的浊度下降的程度越大，当达到12h后，浊度趋于平稳，且随着时间的加长，浊度下降趋于平缓。考虑到反应时间过长，啤酒受外界环境的影响也逐渐加大，品质劣变明显，故选取8h、12h、16h作为正交实验中时间因素的三个水平。

(三)正交优化

1.正交优化结果

表3　正交实验结果表

由表3可知：3个因素对降低啤酒浑浊度影响的主次顺序为B>A>C，即反应温度>酶浓度>反应时间；其最优水平组合为A2B2C2，即酶浓度为0.12mg/100mL、反应温度为50℃、反应时间为12h。

2.最优组合验证实验

对A2B2C2的最优组合进行验证，其啤酒的浑浊度降低为10.80%，该结果比正交试验组合中酶浓度为0.12mg/100mL、反应温度为50℃、反应时间为16h(即第5组)所降低的浊度10.75%略好。

3.最优组合下浊度与蛋白质含量的变化

在最优组合条件下，即酶浓度0.12mg/100mL、反应温度50℃、反应时间12h组合下获得的啤酒，按1.3.1中蛋白质含量测定的方法，测得木瓜蛋白酶处理后的蛋白质浓度为38.69mg/100g；与空白相比可溶性蛋白质浓度下降30.23%，部分蛋白质被分解成多肽等小分子，减少了蛋白质与多酚结合的位点或空间结构，引起其浊度下降10.80%，啤酒得到进一步澄清。

(四)啤酒感观品质的变化

成品啤酒中添加木瓜蛋白酶来降低啤酒的浑浊

表4　啤酒品质的变化

度，在反应发生过程中，由于温度的升高，啤酒可能会出现老化、氧化现象，并伴随氧化味。[13]同时啤酒的酒香也会随着温度升高和放置时间的延长，酒香味、起泡性有所降低。处理组与对照组相比，感观品质略有降低，但尚可接受。

三、结论

向成品黑啤酒中添加木瓜蛋白酶水解蛋白质达到降低黑啤浑浊度的目的，在单因素的基础上进行正交优化，获得酶浓度为0.12mg/100mL、反应温度为50℃、反应时间为12h的最优组合。在此条件下，啤酒的浑浊度降低10.80%；而啤酒蛋白质的浓度下降30.23%，感观品质与对照相比可以接受。

参考文献：

[1]郝爱军，冯丽萍.影响啤酒非生物稳定性的因素探讨[J].山西食品工业，2003(2)：28-29.

[2]李海芹，李娜，刘毅，等.啤酒混浊问题如何解决[J].中外食品，2006(7)：53-55.

[3]张兰威.发酵食品工艺学[M].北京：中国轻工业出版社，2011:177.

[4]王秘.影响啤酒非生物稳定性的因素及预防措施[M].啤酒科技，2008(8)：20-23.

[5]熊华.木瓜蛋白酶的应用研究进展[J].四川食品与发酵，2005，41(4):9-11.

[6]沈悦.番木瓜蛋白酶研究与应用综述[J].科技信息，2008(11)：313-314.

[7]牟利辉.木瓜蛋白酶的应用研究[J].广东化工，2008，35(10):96-98.

[8]乙引，陈平，王茜，等.木瓜蛋白酶改良啤酒品质的研究[J].贵州农业科学，2000，28(4)：14-16.

[9]南宁华南生物工程公司.木瓜蛋白酶在啤酒工业的应用[J].广西轻工业,1998(3)：41-42.

[10]徐玮,汪东风.食品化学实验和习题[M].北京：化学工业出版社，2008:31-32.

[11]GB 4927-2008，啤酒[S].

[12]邵法都.用甲醛和木瓜蛋白酶提高啤酒胶体稳定性的探讨[J].广州食品工业科技，1998，14(4)：31-32.

[13]王健.如何消除氧化味和老化味[J].农产品加工，2006(12)：29.

[责任编辑李潜生]

Study on the Effect of Papaya Proteinase on the Haze of Dark Beer

DING Hai-tao1,YANG Hong1,XU Pei-lin1,ZHANG Jie1，ZOU Le2

(1.Department of Biological and Environmental Engineering, Hefei University, Hefei 230601,China;2.Department of Computer Science and Technology, Hefei University, Hefei 230601,China)

Abstract:In order to reduce the haze of dark beer and preserve the nutritive components at the same time, the papaya proteinase was added to dark beer for decomposing protein. The factors, such as enzyme treatment temperature, treatment time and enzyme concentration, which were been selected to analyze its influence on the haze of dark beer. Orthogonal process optimization was carried out in the single factor experiment results. It was showed that the haze of dark beer could been reduced 10.80% under the concentration of 0.12mg/100mL papaya proteinase, 50℃ of enzyme treatment temperature and 12h of treatment time conditions. The quality of beer could be acceptable on the basis of sensory evaluation. The effect of dark beer clarification could be achieved further.

Key words:papaya proteinase; dark beer; haze

中图分类号：Q946.5；TS262.5

文献标识码：A

文章编号：1008-6021(2016)01-0125-04

通讯作者：杨红(1981-)，男，安徽舒城人，硕士，副教授。研究方向：食品生化与生物统计。

作者简介：丁海涛(1988-)，男，安徽舒城人，硕士研究生。

基金项目：安徽省高校省级优秀青年人才基金重点项目(项目编号：2013SQRL079ZD)；安徽省高校优秀青年人才支持计划重点项目(项目编号：gxyqZD2016269)；安徽省大学生创新创业训练计划项目(项目编号：AH201411059043)；国家级大学生创新创业训练计划项目(项目编号：201511059079)。

收稿日期：2015-12-01