γ-干扰素释放试验在肺外结核诊断中的应用与评价

鲁　曦　李王平　谢永宏

710038 西安，第四军医大学唐都医院呼吸与危重症医学科

孙瑞琳　刘　伟　金发光



·论著·

γ-干扰素释放试验在肺外结核诊断中的应用与评价

鲁曦李王平谢永宏

710038 西安，第四军医大学唐都医院呼吸与危重症医学科

孙瑞琳刘伟金发光

【摘要】目的探讨γ-干扰素释放试验(T细胞斑点试验)在肺外结核诊断中的使用效能。方法通过对265例入组的肺外结核疑似患者进行T细胞斑点试验检测，分析该技术在肺外结核中的诊断效能和影响该检测结果的风险因素。结果265例患者中，确诊肺外结核147例、可疑肺外结核32例、排除结核感染86例。在去除可疑样本之后，T细胞斑点试验灵敏度和特异性分别为81%和53%。其中，T细胞斑点试验对淋巴结核与结核性腹膜炎检测灵敏度最高，均为88%；结核性胸膜炎检测的灵敏度最低，为75%；T细胞斑点试验对淋巴结核检测的特异性最高，为67%；而肠结核检测的特异性最低，仅为44%。在免疫功能低下人群中，其灵敏度较免疫功能正常人群显著降低(P<0.05)。此外，年龄(≥65岁)对T细胞斑点试验灵敏度及对阳性预测值和阴性预测值的影响具有统计学意义(P<0.05)。结论T细胞斑点试验能够作为疑似肺外结核鉴别的辅助诊断工具，具有较高的灵敏度，但在不同感染部位的检测效能不同。T细胞斑点试验检测结果受到患者免疫功能状态与年龄的影响，因此在进行该项检测之前有必要对患者免疫状态等相关因素进行评估。

【关键词】肺外结核；γ-干扰素释放试验；T细胞斑点试验

肺外结核在发展中国家的年发病率呈升高的趋势[1]，这与免疫抑制患者(例如艾滋病患者和接受肿瘤坏死因子-α拮抗剂治疗的患者)数量增多具有一定相关性[2-4]。然而，肺外结核患者的样本不易获得，而且检测方法灵敏度较低，这大大增加了诊断难度[5]。随着免疫抑制剂治疗方案的推广，对于结核病的早期诊断与及时干预显得比以往更加重要[3，6]。

目前，结核菌素试验在检测结核分支杆菌感染和指导治疗方面应用广泛，但是该方法在免疫力受到抑制的肺外结核患者中反应性较低，而且受到卡介苗接种的影响[7]。其他传统方法例如抗酸染色、结核菌培养和病理活检等技术虽然对结核病的诊断提供了很大帮助，但是获得合适样本的难度较大，而且样本的获取对患者也存在一定风险，即使获得了合适的样本，由于抗酸染色和结核培养阳性率低、病理缺乏诊断依据，因此阴性结果也难以排除结核感染。

γ-干扰素释放试验T细胞斑点试验(T cell spot test, T-SPOT)技术基于2种结核分枝杆菌特异性抗原(早期分泌抗原靶蛋白ESAT-6和培养滤过蛋白10，CFP-10)，通过检测T细胞释放的γ干扰素，间接诊断机体的结核菌感染状态。编码以上2种特异性抗原的基因均位于结核分枝杆菌基因组上的RD1区，绝大多数非结核分枝杆菌和卡介苗的基因组中均不存在该区域[8-9]。该技术无需受累器官的组织样本，仅需要患者外周血即可，并在结核病诊断中的应用得到了许多学者和临床工作者的认同[9-10]。

本研究分析了T细胞斑点试验在肺外结核诊断中的作用，及影响该检测的2个风险因素，旨在为该技术在肺外结核的诊断中提供参考。

对象与方法

一、研究对象

选取唐都医院自2012年6月至2014年6月住院疑似肺外结核患者265例。入组标准为出现任何肺外结核症状、体征或影像学证据的肺外结核疑似患者。其诊断标准参见文献[11]，其中确诊肺外结核感染定义为：肺外临床样本结核分枝杆菌培养阳性或PCR阳性。疑似肺外结核患者定义为：临床症状或各项检查化验结果与活动性结核类似；活检标本提示干酪样坏死或肉芽肿性炎，胸腔积液、腹腔积液临床病变与结核性胸膜炎、结核性腹膜炎类似。排除结核感染定义为：使用抗结核以外的治疗方式使其临床症状得以缓解，或最终临床确诊为其他疾病。可疑肺外结核患者定义为：不满足上述标准，但也无法排除肺外结核感染的患者。免疫功能低下患者的标准为：HIV感染者、肝硬化、慢性肾功能衰竭和接受免疫抑制剂治疗的患者[12]，见表1。

表1　233例肺外结核疑似患者基本信息a[n(%)]

注：a本表统计了肺外结核感染确诊病例和排除结核感染病例的人数(百分比)，或检测阳性人数/进行检测人数(百分比)；b已排除可以肺外结核病例;c其他病症包括糖尿病、呼吸道感染、肝硬化和结缔组织病

二、试剂与仪器

1. 主要试剂：美德斯坦姆细胞培养液(1640培养液)、AIM-V细胞培养液和人淋巴细胞分离液(医用级)，以上试剂由天津美德太平洋科技有限公司生产；结核感染T细胞检测试剂盒(免疫斑点法)由英国Oxford Immunotec Ltd.生产；PBS缓冲液 pH7.4(10×)由上海双螺旋生物科技有限公司生产。

2. 主要仪器：Heal Force二氧化碳培养箱(HF151UV)、湘仪CENCE低速离心机(L550)、海尔二级生物安全柜(HR40-IIa2)。

三、T-SPOT试验

1. 样本采集：静脉血样本用肝素锂或肝素钠抗凝管采集3～5 ml外周血，立即颠倒2～3次充分混匀，以免血液凝固。在常温下(18～25 ℃)保存，并在3 h以内将样本送至实验室，对于不符合采样要求，或没能及时送达实验室的样本则需重复采样。

2. 单个核细胞分离：使用人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，首先将4 ml外周血和3 ml的1 640培养液混匀，随后缓慢加入到3 ml人淋巴细胞分离液中，使血液浮于分离液上层，随后1 000×g离心22 min。取分离后的细胞层5 ml，用1 640培养液洗涤2次，350×g离心7 min弃上清。将沉淀加入500 μl的AIM-V培养液并混匀。对每份样本并用细胞计数板在显微镜下进行细胞计数。并将细胞浓度调整至2.5×106/ml。

3. γ-干扰素释放试验：具体操作步骤和结果判断方法，严格按照结核感染T细胞检测试剂盒使用说明进行操作和判断。

四、质量控制

1. 样本质控：对于保存温度低<4 ℃或>28 ℃的样本，和保存时间>5 h的样本以及未按要求使用肝素抗凝的样本需要重新采样。对于原始细胞浓度<2.5×106/ml的样本不进行T-SPOT检测。

2. 试验过程质控：在实验过程中按照试剂盒使用说明，每个样本均设立阳性对照和阴性对照。阴性对照用于对环境污染状况和样本中的背景γ-干扰素进行质控，确定进行试验的样本无环境污染和γ-干扰素污染。阳性对照用于对试剂的有效性以及单个核细胞释放γ-干扰素的能力进行质控。对于阴性对照>10个斑点首先需要对操作环境进行清洁，重新采样再次送检。对于阳性对照<20个斑点的样本需要间隔2周之后重新采样送检。

3. 注意事项：实验操作应在生物安全柜中进行，使用前后使用紫外、酒精消毒，二氧化碳培养箱每周进行1次消毒；实验所需耗材需要高压灭菌，对于自行灭菌的物品放置时间>1周或使用前包装破损的需要重新灭菌或丢弃；试验中使用到的AIM-V和1 640培养液用50 ml离心管分装，剩余量需丢弃。

五、统计分析

采用SPSS18.0版本软件，计数资料采用χ2检验。以P<0.05作为差异有统计学意义。对T-SPOT技术在肺外结核诊断中的性能，包括灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比，利用Youden指数(PI=灵敏度+特异度-1)和阴性似然比进行评价。

结果

一、患者诊断结果

总计有265例肺外结核疑似患者入组，根据临床症状、细菌学、组织病理学和放射学等相关技术对肺外结核进行诊断，共确诊肺外结核147例(55%)、排除结核感染86例(32%)、其余32例(12%)为无法排除结核感染的可疑病例。共有88例患者进行了组织病例活检，其中58例为肉芽肿性炎(81%)；97例进行了抗酸染色，4例为阳性(5%)；80例进行了结核PCR检测，其中有49例阳性(75%)。在265名疑似病例中，共有181例(68%)为T-SPOT阳性，84(32%)为T-SPOT阴性。本研究将确诊的147例肺外结核病例作为肺外结核阳性参照病例，86例排除结核感染病例作为肺外结核阴性参照病例，因为其余32例无法确诊，所以不列在统计范围之内，见表1。

二、T-SPOT试验在肺外结核辅助诊断的临床表现

对265例肺外结核疑似患者的血液进行T-SPOT试验，试验的全部过程根据质量控制方案严格进行。T-SPOT针对不同感染部位，其灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比，见表2。其中质控结果均未出现异常。在排除32例无法确诊结核的病例后，T-SPOT对肺外结核检测的灵敏度和特异性分别为81%和53%，阳性预测值和阴性预测值分别为75%和62%，阳性似然比和阴性似然比分别为1.74和0.36，见表2。根据不同感染部位，灵敏度从88%(淋巴结核和肠结核)到75%(结核性胸膜炎)，特异性从44%(肠结核)到67%(淋巴结核)，阳性预测值从36%(骨结核)到93%(淋巴结核)，阴性预测值从45%(结核性胸膜炎)到90%(骨结核)不等，见表2。为对比几种不同部位肺外结核的诊断效果，本研究利用了Youden指数对结果进行评价，发现淋巴结核最高(0.55)，其次是结核性腹膜炎(0.40)、骨结核(0.33)、肠结核(0.32)、结核性胸膜炎分别为(0.29)。

表2　T-SPOT试验在233例疑似肺外结核患者诊断中的效果分析

注：aT-SPOT检测结果阳性患者数/参与检测并且肺外结核确诊患者人数；bT-SPOT检测结果阴性患者数/参与检测并且排除肺外结核患者人数；cT-SPOT阳性样本中真阳性患者数/T-SPOT阳性样本数；dT-SPOT阴性样本中真阴性患者数/T-SPOT阴性样本数

三、影响T-SPOT试验的风险因素

本研究分析了免疫功能状态对T-SPOT肺外结核检测的影响，发现T-SPOT对免疫力正常患者和免疫力低下患者的灵敏度分别为85%和57%，经过χ2检验，P<0.05，差异具有统计学意义。此外，本研究还分析了年龄对该检测的影响，见表2，选择65岁做为分界点。其中有129名年龄≥65岁的患者，有63名被诊断为肺外结核感染(患病率为49%)，其中有56例为T-SPOT阳性(灵敏度为89%)；在104例年龄<65岁年龄的患者中有84例为肺外结核患者(患病率为81%)，其中有63例为T-SPOT阳性(灵敏度为75%)。其灵敏度在不同年龄组中差异具有统计学意义(P<0.05)。这提示患者年龄因素对T-SPOT在肺外结核诊断中的灵敏度具有显著影响。在≥65岁年龄组中，有40例得到T-SPOT阴性结果，其中有33例排除结核感染，其阴性预测值为83%，较<65岁年龄组高(90%)，差异具有显著性(P<0.05)；在89例得到T-SPOT阳性结果的患者中仅有63例确诊为肺外结核，阳性预测值仅为63%，而在<65岁年龄组中阳性预测值为90%，其差异具有显著性(P<0.05)，此外在年龄<65岁组和≥65岁组患者T-SPOT灵敏度分别为75%和89%。

讨论

根据国外文献报道，25%～30%的结核病属于肺外结核，而在中国，这一比例占到9.7%～11.8%[12]。由于肺外结核临床症状和指征缺乏特异性，而且传统方法给肺外结核的诊断带来了很大难度。之前，大量研究已经证实T-SPOT检测对于结核病的诊断具有较高的灵敏度，且不受卡介苗接种的影响[9]。而针对国内T-SPOT对肺外结核检测的研究数据较少文献[12]，因此本研究着重分析了T-SPOT在肺外结核中诊断的实际效果，对肺外结核中不同感染部位的灵敏度、特异性等进行分析。本次共有265例肺外结核疑似患者入组，其中233例确诊明确。根据本次研究数据，T-SPOT在肺外结核诊断中的灵敏度和特异性分别为81%和53%，阳性预测值和阴性预测值分别为75%和62%。其中在淋巴结核与肠结核的诊断中灵敏度最高，均为88%。淋巴结核检测的特异性最高，为67%。Youden指数也表明淋巴结核最高，为0.55。以上数据说明，T-SPOT在肺外结核不同感染部位的检测效能不同，其中淋巴结核较其他部位的准确度高，这与文献的研究结果基本一致[10]。此外，骨结核的灵敏度和特异性分别为83%与50%，与国外研究结果(100%和55%)存在差异，或许是因为与此次入组的骨结核患者人数较少有关(仅有6例确诊)[10]。

同时本研究还分析了患者免疫功能状态和年龄对T-SPOT检测的影响。发现免疫功能正常患者T-SPOT的灵敏度高于免疫功能低下患者，分别为85%和57%，P<0.05差异具有统计学意义。以往的相关数据表明[13]，T-SPOT技术不受患者免疫功能状态的影响，但是本研究的数据提示患者免疫功能状态会影响到T-SPOT检测的灵敏度。推测这可能是由于免疫细胞的生物活性对检测结果产生的影响；另外，本研究入组患者年龄中位数>65岁，考虑年龄因素和免疫功能因素的叠加也可能是影响T-SPOT灵敏度的原因。为了保证T-SPOT试验数据的可靠性，对年龄≥65岁而且免疫功能下降的人群应当谨慎使用T-SPOT进行辅助诊断。但是这一结论仍有待大样本量的研究数据支持。此外，本研究还单独分析了年龄(≥65岁)对T-SPOT检测的影响，除灵敏度以外，特异性、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值均与年龄<65岁组具有显著差异。其中，≥65岁组患者T-SPOT特异性(50%)、阳性预测值(63%)与<65岁组患者的T-SPOT特异性(65%)、阳性预测值(90%)相比均发生降低，但阴性预测值有所提高，<65岁组阴性预测值为38%，≥65岁组为83%，以上数据说明，<65岁的T-SPOT阳性患者，提示肺外结核感染的可能性较≥65岁年龄组的患者大；而对于≥65岁的T-SPOT阴性患者，提示排除肺外结核感染的可能性较<65岁组大。综上所述，除了患者免疫功能状态之外，年龄也是影响T-SPOT诊断效能的重要风险因素。造成≥65岁年龄组阳性预测值显著降低的主要原因，推测是由于老年患者潜伏性结核发生率较<65岁年龄组的患者高[17]。以上结果说明，T-SPOT在不同年龄组中肺外结核诊断效能不同：对于<65岁的T-SPOT阳性患者，提示肺外结核感染的可能性较≥65岁年龄组的患者大；而对于≥65岁的T-SPOT阴性患者，提示排除肺外结核感染的可能性较<65岁组大。

本研究发现，T-SPOT对肺外结核的灵敏度和特异性分别为81%和53%，与以往报道的存在一定差异[11，14]。造成这种差异可能原因之一是T-SPOT无法区分活动性结核和潜伏性结核[15]。由于我国属于结核感染高负担国，潜伏性结核感染者比例较高，有10%～20%的潜伏性结核患者[16-17]。而且缺乏潜伏性结核诊断的金标准，这大大增加了排除结核感染的难度。本研究发现在排除结核感染的86例患者中，仅46例呈T-SPOT阴性结果，其余40例阳性患者中有16例有过结核病接触史。由于T-SPOT无法对活动性和潜伏性结核进行区分[15]，对于T-SPOT阳性，但最终其他临床却排除结核感染的患者有可能属于潜伏性结核，而这一部分数据影响了试验的特异性。因此结核的诊断仍需结合患者临床表现、接触史和其他检测技术进行综合判断。

T-SPOT技术在肺外结核诊断中具有以下优势：首先，T-SPOT试验仅需要血液或体液样本，使得样品容易获得。其次，由于该试验使用的两种刺激抗原(ESAT-6和CFP10)，其编码基因位于结核分枝杆菌基因组RD1区域，该区域在卡介苗中不存在，这就避免了卡介苗接种对该试验的影响；同样，该区域在绝大多数环境分枝杆菌中亦不存在，因此大大提高了检测的特异性。其次，该试验在刺激干扰素释放之前，先将单个核细胞稀释到同一浓度，这减少了患者白细胞数降低对该试验的影响。此外，T-SPOT检测在24 h内即可完成，虽然PCR技术和抗酸染色具有更短的检测周期，但需要肺外结核患者提供组织，且不易获得，这就限制了PCR和抗酸染色技术在肺外结核诊断中的应用，而抗酸染色阳性率低，抗酸阴性的患者也难以排除结核感染。结核菌培养和组织活检是结核诊断的金标准，除了样本难以获得之外，56 d的培养周期也难以满足快速检测的要求，而结节病与结核在病理活检中也存在一定程度的交叉，而T-SPOT技术能够大大改善上述方法的弊端。然而该技术也存在一定程度的劣势，由于该技术是通过检测结核感染患者的效应T细胞进行间接诊断的，因此无法对活动性结核与潜伏性结核进行区分。而鉴别活动性与潜伏性结核的技术仍有待进一步开发。

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(本文编辑：张大春)

鲁曦，李王平，谢永宏，等. γ-干扰素释放试验在肺外结核诊断中的应用与评价[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2015， 9(1)： 20-25.

Evaluation of interferon-gamma release technique in extra-pulmonary tuberculosis detectionLuXi,LiWangping,XieYonghong,SunRuilin,LiuWei,JinFaguang.DepartmentofPulmonaryandCriticalCareMedicine,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an, 710038

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the clinic presentation of interferon-gamma release method (T cell spot test) in extra-pulmonary tuberculosis (E-TB) diagnosis. MethodsTotally 265 suspect E-TB patients were included in the study. The clinic practice and risk factors were analyzed. ResultsAmong the 265 cases, there were 147 were diagnosed as E-TB infection that confirmed by bacteriology or histology. E-TB was excluded in 86 patients, and the rest of 32 cases still cannot be diagnosed. After the suspicious cases removed, the sensitivity and specificity of T cell spot test assay were 81% and 53%. Among them, the sensitivity in crewels and tuberculous peritonitis detection was higher than others (both 88%); in tuberculous pleuritis detection was 75%. The specificity in crewels was higher than others (67%); in tuberculosis of intestine detection was only 44%.The sensitivity in immunecompromised group were decreased significantly(P<0.05), besides, the sensitivity was also affected by age factor (≥65y, P<0.05). There was statistically significant in potitive predictive value and negative predictive value(P<0.05). ConclusionsT cell spot test TB is an effective tool for extra-pulmonary tuberculosis diagnosis with high sensitivity. Besides, the results can be affected by the condition of patients′immunologic function and age factor(≥65y). So, it is necessary to test the the immune status of the patient before making the T cell spot test detection, and age factor should also be considered.

【Key words】Extra-pulmonary tuberculosis;Interferon-gamma release method;T cell spot test

(收稿日期：2015-11-16)

Corresponding author：Jin Faguang, Email：jinfag@fmmu.edu.cn

中图法分类号：R562

文献标识码：A

通讯作者：金发光，Email：jinfag@fmmu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金资助(31300121)

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.01.006