龙血素B对纤溶酶原激活物抑制剂的抑制作用

闫冬

（辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁大连116081）

龙血素B对纤溶酶原激活物抑制剂的抑制作用

闫冬

（辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁大连116081）

纤溶酶原激活物抑制剂1（Plasiminogen Activator Inhibitor-1，PAI-1）是一种分泌型单链糖蛋白，是丝氨酸蛋白水解酶抑制剂家族的成员之一。在纤溶系统中，PAI-1是尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type Plasiminogen Activator,uPA）和组织型纤溶酶原激活物（tissue-type Plasiminogen Activator,tPA）的天然特异性的抑制剂。PAI-1的异常表达会引起体内凝血和抗凝血系统的紊乱，从而导致血栓类疾病的发生。本实验利用底物荧光发色法确定龙血素B对PAI-1具有的抑制作用。因此，以PAI-1作为分子靶标，龙血素B可能为研发治疗血栓类相关疾病奠定了理论基础。

龙血素B；PAI-1；抑制剂；血栓

龙血竭（亦称广西血竭）是百合科植物龙血树属剑叶龙血树的含脂木材经乙醇提取而得到的树脂，是常用的活血化瘀中药，有散瘀生新、活血止痛、止血生肌等功效。其中，龙血素B是龙血竭质量标准中的重要指标[1]。本实验室通过前期工作从大批量天然中草药中筛选得到龙血素B，本实验对其是否拥有纤溶酶原激活物抑制剂抑制作用进行如下检测。

1 利用底物发色法测定龙血素B对PAI-1的抑制活性

PAI-1是尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）的天然抑制剂[2]，S2444是uPA的特异性底物，uPA能水解S2444使其释放出黄色的pNA。uPA的活性可以通过其水解S2444产生的黄色速率来测定。在405nm下，pNA有最大的吸光度，其他则无吸光值。反应最终体系为：龙血素B 50μM，50mM Tris-HCl pH为7.5，150mM NaCl，2.5mM CaCl2，0.02%BSA，2%DMSO，0.1%PEG6000，10nM PAI-1，10nM uPA，32μM S-2444。结果表明，龙血素B具有抑制PAI-1活性。

2 活性小分子抗PAI-1剂量依赖测定

取5mM的龙血素B利用倍比稀释法在反应 buffer中稀释为 400、200、100、50、25、12.5μM和0μM，转移至96孔板中。将同样剂量的PAI-1加入反应体系中，23℃静置15min。然后加入uPA，23℃下静置5min后转移至37℃恒温箱中孵育10min。最后加入发色底物S2444，混匀后在酶标仪的Kenetic模式下，测定0min和30min波长405nm的吸光度。由此可以计算体系中剩余PAI-1的活性：PAI-1activity（%）=1-ΔO. D405nmcompound30min/ΔO.D405nmuPA30min。ΔO.D405nmcompound30min表示体系中纯在小分子化合物和PAI-1的情况下，37℃，波长405nm下uPA水解发色底物反应中第1min与第30min吸光度的变化；ΔO.D405nmuPA30min表示反应体系中只存在uPA的情况下，uPA水解发色底物吸光度第1min和第30min的变化。结果证明，龙血素B对PAI-1的抑制呈现一定的剂量依赖性。

3 通过SDS-PAGE检测龙血素B对uPA/ PAI-1复合物形成的影响

采用倍比稀释法用事先配好的TBS缓冲液稀释龙血素B终浓度为100、50、25、12.5、0μM。加入10μL PAI-1，23℃孵育15min。然后加入10μL 的uPA，37℃反应10min。加入5μL非还原性loading buffer。将混合好的样品沸水中煮3min。之后用10%的SDS电泳90V电泳1.5h。在37℃下用考马斯亮蓝染色40min，在用脱色液多次脱色。结果表明，龙血素B能对PAI-1和uPA的复合物形成产生影响，这种影响具有一定的剂量依赖性。

4 血浆纤维蛋白实验

在96孔板中将药品倍比稀释成最终浓度为400、200、100、50μM和25μM。加入5μL PAI-1在室温下反应15min，然后加入2μL uPA在37℃下孵育10min。将人血浆与65μL的反应体系（其中包括150mM NaCl，2mM CaCl2，20mM HEPES， pH7.4）混合，然后加入人凝血酶促进纤维蛋白形成，在37℃下反应10min，确保形成的纤维蛋白在2h内保持稳定。然后，将之前准备好的样品相互混合，混匀。用酶标仪测定其在405nm的光吸收值。结果显示，纤溶酶能促进血纤维溶解，使吸光度变小。随着小分子抑制剂剂量的增加，PAI-1的活性随之降低，uPA的活性反之增高，溶解血纤维蛋白的速率增加。

5 小结

血竭是我国传统名贵中药，其应用已有1 500余年的历史，在古医学中多有记载。《本草纲目》谓其能散滞诸痛，《本草经疏》也有血竭为散瘀血之要药的论述[3]。血竭在临床上常用于外科、骨伤科、内科、妇科。现代医学研究表明，血竭既能使处于高凝状态的血液重新流通，起到活血化瘀的作用，又能使处于低凝状态的血液在血管破口处凝固而使出血停止，起到收敛止血的作用，在中医治疗血证方面具有双向调节作用。本实验研究表明，血竭中的龙血素B通过阻止PAI-1和uPA的复合物形成对PAI-1具有特异的抑制活性，并且这种抑制作用具有剂量依赖性。进一步研究表明，说明龙血素B具有较好的抗血栓、抗血瘀、抗凝血等活血化瘀药理作用。这为龙血素B及血竭的进一步开发利用提供了实验依据。

[1]陈奇主.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,1993:377,484,564,571.

[2]Amy Liang, Faye Wu, Kathy Tran. Characterization of a small molecule PAI-1inhibitor, ZK4044[J]. Thrombosis Research, 2005,115(4):341-350.

[3]李枫,张蓓蕾.活血圣药- 血竭研究综述[J].上海医药,1998,19(8): 33.

Inhibitory Effects of Loureirin B on Plasminogen Activator Inhibitor

Yan Dong
(College of Life Science, Liaoning Normal University, Liaoning Dalian 116081)

Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) is a member of the serine protease inhibitor gene family and is the major inhibitor of both tissue-type plasminogen activator (tPA) and urokinase-type plasmanogen activator (uPA) invivo. In the fibrinolytic system, PAI-1 is the natural specific inhibitors of both uPA and tPA. The abnormal expression of PAI-1 can cause the disorder of coagulation and anti coagulation system in the body, which can lead to the occurrence of thrombotic diseases. This experiment used fluorogenic substrate colorimetry method to determine the Loureirin B on PAI-1 has inhibitory effect; therefore the PAI-1 as a molecular target, Loureirin B might be for the development of treatment of thrombosis related diseases has laid a theoretical foundation.

Loureirin B; PAI-1; Inhibitor; Thrombosis

R285

A

2096-0387（2016）02-0049-02

闫冬（1989-），男，辽宁盘锦人，硕士研究生，研究方向：分子遗传学。