基于HepG2体外细胞培养的旋覆花抗肿瘤有效组分的提取工艺

2016-04-08黄一凡孟宪生包永睿

中成药 2016年2期

关键词：正交设计抗肿瘤层次分析

黄一凡，王帅，2，3，孟宪生，2，3*，包永睿，2，3

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁大连116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁大连116600）

基于HepG2体外细胞培养的旋覆花抗肿瘤有效组分的提取工艺

黄一凡1，王帅1，2，3，孟宪生1，2，3*，包永睿1，2，3

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁大连116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁大连116600）

摘要:目的优选旋覆花抗肿瘤有效组分的提取工艺。方法采用正交实验设计，对影响提取工艺的3个因素（提取时间、提取次数、乙醇用量）进行考察，以肿瘤抑制率为考察指标来优选最佳提取工艺。同时结合层次分析法，优选以总黄酮含有量和出膏率为综合评价指标的权重系数及其范围，并采用Pearson相关性分析对其进行验证。结果最佳工艺条件为20倍量55％乙醇，回流提取3次，每次1 h。以总黄酮含有量和出膏率为指标的综合权重系数范围为0.75～0.90、0.10～0.25。结论该优化工艺在保证药效的前提下，简化了考察指标，避免了复杂的操作，可为其他中药材有效组分提取工艺的优选提供了思路和方法。

关键词:旋覆花；抗肿瘤；正交设计；层次分析；抑制率；权重系数

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.050

旋覆花为菊科植物旋覆花Inula jaPonica Thunb.或欧亚旋覆花Inula britannica L.的干燥头状花序［1］，其化学成分主要有黄酮类、倍半萜内酯类、三萜、甾体和挥发油成分［2］，具有抗炎、保肝、抗肿瘤等多种生物活性。已有文献报道，旋覆花的抗氧化活性与其含有的黄酮有关［3］，但未见其抗肿瘤方面的相关报道。本实验基于HePG2细胞体外药效实验，通过正交实验设计，以肿瘤细胞抑制率为指标，对旋覆花抗肿瘤有效组分的提取工艺进行筛选，并结合层次分析法，优选可代替药效指标综合评分的权重系数，为该植物的合理开发和利用奠定基础。

1 仪器和材料

UV-1750紫外可见分光光度计（岛津仪器苏州有限公司）；Sunrise型酶标仪（奥地利Tecan公司）；UAIRETM US Autof1ow型CO2培养箱（美国Nuaire公司）。

旋覆花药材购自大连民大中药饮片有限公司，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为欧亚旋覆花Inula britannica L.的干燥头状花序。芦丁（含有量测定用，中国药品生物制品检定所，批号100080200707）。DMEM培养粉、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐（MTT）、胎牛血清（美国Gibco公司）；二甲基亚砜（北京索莱宝科技有限公司）；人肝癌细胞株HePG2（大连医科大学）。所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 旋覆花总黄酮含有量的测定

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.20 mg的溶液，即得。

2.1.2 检测波长的选择取对照品溶液和正交试验中的1号样品溶液（15倍55％乙醇提取1 h一次，总黄酮含有量为7.246％）各2 mL，置于25 mL量瓶中，加入5％亚硝酸钠（现配）1 mL，放置6 min，再加入10％硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，再加入4％氢氧化钠10 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，以不加芦丁的试液为空白对照，于400～800 nm处扫描。结果，对照品溶液和样品溶液均在510 nm处有最大吸收，故确定510 nm作为检测波长［4-5］。

2.1.3 标准曲线的绘制精密吸取芦丁对照品溶液0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.1.2”项下方法操作，以芦丁的质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，回归方程为Y=12.41X+0.004 6，r=0.999 5，表明芦丁在0.012～0.048 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2 HePG2细胞培养与药效学检测

2.2.1 细胞培养细胞株培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中（含青链霉素100 U/mL），于37℃、5％ CO2培养箱内连续培养。细胞长满后，用0.25％胰蛋白酶消化，传代培养。

2.2.2 MTT法细胞抑制率检测取处于对数生长期、生长状态良好的HePG2细胞，用胰酶制成细胞悬液并计数，调整细胞密度为5×104/mL，加入96孔培养板中，每孔100 μL，于37℃，5％CO2饱和湿度下培养24 h后，实验组加入样品溶液100 μL（每组设5个复孔），空白对照组加入等体积的培养液。继续培养24 h后，避光下每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，继续孵育4 h，弃除上清液，每孔加入DMSO150 μL，摇床上振摇10 min后，于酶标仪492 nm处测定吸光度（A值），计算药物对细胞的增殖抑制率。抑制率=（1-试验组A值/对照组A值）×100％。

2.3 提取工艺的考察

2.3.1 醇浓度单因素考察对0％、35％、55％、75％、95％乙醇进行考察，其总黄酮含有量分别为4.71％、6.61％、7.10％、6.17％、2.15％。结果表明，55％乙醇对旋覆花中总黄酮类成分的提取率最高，因此选用55％乙醇作为最佳提取溶剂。

2.3.2 提取工艺的正交实验设计精密称取旋覆花粉末10 g，以55％乙醇为提取溶剂进行提取。选择提取时间、提取次数、乙醇用量作为考察因素［6］，各因素取3个水平，以细胞抑制率为指标，进行L9（34）正交试验考察。称取9组正交设计的提取物粉末（相当于0.1 g生药材）溶解，2‰DMSO助溶，0.22 μm微孔滤膜滤过，作用于HePG2细胞，以细胞抑制率为指标，优选提取工艺，结果见表1和表2。

表1　正交试验设计及直观分析结果

表2　正交试验方差分析

以细胞抑制率为指标，直观分析及方差分析影响提取工艺的因素顺序为B＞C＞A，其中提取次数（B）、乙醇用量（C）对细胞抑制率影响较大，而且有显著性差异（P＜0.05）。另外，提取次数为3次时，已达到工厂日工作量，因此不再增加提取次数，确定最佳提取次数为3次。由于乙醇用量（C）也是影响提取工艺的主要因素，故为验证优选乙醇用量的准确性，在其他提取条件均为最优时，对其进行单因素考察。

分别对17.5、20、22.5倍乙醇用量进行单因素考察，发现细胞抑制率分别为62.79％、65.17％、65.19％，即乙醇用量为20倍时，细胞抑制率明显高于17.5倍，而与22.5倍的抑制率相差不大。因此，从节约溶剂的角度考虑，确定溶剂用量为20倍。

综上所述，筛选出的最佳提取条件为A1B3C2，即20倍量55％乙醇，回流提取3次，每次1 h。

2.4 层次分析法对总黄酮含量和出膏率权重系数的确定以总黄酮含有量和出膏率为指标，评价旋覆花抗肿瘤有效组分的提取工艺，建立评价目标树图，结果见图1。

图1　旋覆花抗肿瘤有效组分提取工艺的评价目标树

通过比较同一层次目标（即总黄酮含有量和出膏率）的相对重要程度，构成一系列两两比较矩阵。通过AHP软件，计算权重系数随机一致性比率CR（CR=CI/RI），其可作为衡量所得权重系数是否合理的指标。通过软件，得到9组CR=0.000 0＜0.1，即认为矩阵具有满意的一致性，表明9组权重系数合理有效，可用于提取工艺优选的综合评分中，见表3。

表3　两种指标在不同重要程度下的权重系数

按照各指标不同的权重系数来计算综合评分，作为提取工艺的评价指标，以“比较重要”为例（总黄酮含有量和出膏率的权重系数分别为0.833 3、0.166 7、0.166 7、0.833 3），实验设计和结果见表4和表5［综合评分1 =（总黄酮含有量/最大总黄酮含有量）×0.833 3 +（出膏率/最大出膏率）×0.166 7；综合评分2 =（总黄酮含有量/最大总黄酮含有量）×0.166 7 +（出膏率/最大出膏率）×0.833 3）］。

表4　正交试验设计及直观分析结果

表5　正交试验方差分析

以综合评分1为指标，直观分析及方差分析影响提取工艺的因素顺序为B＞C＞A，其中提取次数（B）影响最大，而且有显著性差异（P＜0.05）。另外，提取次数为3次时已达到工厂日工作量，因此不再增加提取次数，确定最佳提取次数为3次。另外，乙醇用量和提取时间无显著性差异（P＞0.05），而且20倍和25倍乙醇用量相差不大，从节约溶剂角度考虑，确定乙醇用量为20倍；提取时间也相差不大，因此为提高生产效率、节约成本，确定提取时间为1 h。综上所述，最佳提取条件为A1B3C2，即20倍量55％乙醇，回流提取3次，每次1 h。

以综合评分2为指标，直观分析及方差分析影响提取工艺的因素顺序为B＞A＞C，各因素均无显著性差异（P＞0.05）。从提高生产效率和节约溶剂角度考虑，优选出的工艺条件为A3B2C2，即20倍量55％乙醇，回流提取2次，每次3 h。

当总黄酮含有量和出膏率的权重系数分别为0.833 3、0.166 7时，以综合评分与细胞抑制率为指标优选的最佳提取条件一致，说明在此权重系数下，两者的综合评分可代替抑制率，作为旋覆花抗肿瘤有效组分提取工艺的考察指标。当权重系数为0.166 7、0.833 3时，与以药效为指标优选出的提取工艺不一致。

同时，对其它7组权重系数计算综合评分，进行正交试验直观分析和方差分析，得到总黄酮和出膏率最佳的权重系数范围分别为0.75～0.90、0.10～0.25。在此权重系数范围内，其综合评分可代替抑制率，作为提取工艺的考察指标。

2.5 验证试验平行称取3份等量药材，按照优选出的最佳提取工艺进行提取，按“2.1”、“2.2”项下方法验证提取工艺的稳定性。结果，总黄酮含有量为8.952％、8.810％、8.783％，出膏率为20.87％、21.16％、20.17％，细胞抑制率为63.13％、65.76％、66.48％，3项指标的RSD分别为1.03％、2.45％、2.71％，说明优选的提取工艺稳定可行，而且药效学结果稳定。

选取2个权重系数范围内外的数值，对其综合评分分别与细胞抑制率进行Pearson相关性分析［7-10］，确定权重系数范围的准确性和合理性，结果见表6。

表6　权重系数范围验证结果

由表可知，在确定的权重系数范围内，综合评分与细胞抑制率的相关系数较大；在权重系数范围外，相关系数较小，说明总黄酮含有量和出膏率的权重系数范围是合理的。

3 讨论

旋覆花为常用的止咳化痰、降逆止呕中药，临床疗效显著，同时具有抗炎、抗肝炎、抗肝损伤、抗肿瘤等多种生物活性。由于文献并没有其在抗肿瘤有效组分提取工艺方面的报道，因此本实验对其进行研究，为开发以旋覆花为原料的，具有广泛临床使用价值和商业开发价值的抗癌新药提供理论和实验依据。

中药化学成分复杂，每味中药相当于一个复方，包含各种化学物质组，其之间相互影响，同时各有效物质组内单体成分之间也有相互影响，因此有效组分的含有量与药效之间并不呈完全线性相关。若只单纯以有效组分或指标性成分的含有量为提取工艺的考察指标，不能保证优选的提取工艺所提组分的药效能够达到最佳，存在片面性；若以细胞抑制率为评价指标，虽能保证提取工艺的药理药效，但操作复杂、耗时。因此，本实验针对中药多组分、复杂性的特点，运用多指标综合评价方法［11-14］中常用的层次分析法，将旋覆花抗肿瘤有效组分提取工艺的评价目标构成单层次、两指标体系，在主观判断的基础上作进一步数学处理，使其在权重系数的赋予上更加科学、合理，同时建立总黄酮含有量、出膏率与药效的关联，即以抑制率为指标的正交试验结果，优选代替抑制率的总黄酮含有量和出膏率综合指标的权重系数及其范围。本实验筛选出影响评价目标（提取工艺）的主要和次要相关指标，避免了工业生产中赋予权重系数的偶然性，不仅能确保提取工艺的药理药效，还简化了考察指标，避免操作的复杂性，使优选的工艺更加合理可行，为旋覆花抗肿瘤有效组分提取工艺的优选提供方便。

通过Pearson相关性分析，当总黄酮含有量和出膏率的权重系数为0.80、0.20时，其与抑制率的相关系数为0.850 7；当两者为0.20、0.80时，相关系数为0.684 9。由此可知，在确定的权重系数范围内，综合评分与细胞抑制率的相关系数较大；在权重系数范围外，相关系数较小，验证了综合评分权重系数范围的合理性，同时证明了总黄酮含有量的相对出膏率更为重要，在合理的权重系数范围内，其综合评分可代替药效指标，作为其抗肿瘤有效组分提取工艺的评价指标。总黄酮含有量和细胞抑制率的相关系数为0.862 5，两者呈一定的相关性，即量效关系，说明总黄酮类成分为其抗肿瘤的有效组分。但量效关系并不为函数关系（完全相关），其影响因素很多，一方面可能由于旋覆花中抗肿瘤有效组分种类复杂，黄酮类成分只是其中一部分，同时药材中也存在抑制其发挥药效的成分；另一方面，黄酮类成分是一类有效组分，不同单体对药效贡献的大小不尽相同。当干膏中总黄酮的含有量升高时，发挥药效与不起作用的单体成分含有量的变化不一致，因此总黄酮的含有量与药效的量效关系并不呈完全相关。

以药效指标为导向的药材提取工艺研究虽能从根本上保证其药理药效，但本实验以综合评价指标代替药效，使得相关研究有了新的思路。对旋覆花抗肿瘤有效组分的提取工艺进行研究可为该植物的开发和利用奠定物质基础，为临床抗肿瘤新药的研制提供理论依据，同时也为工业生产和中药及其复方提取工艺的合理优选提供参考和借鉴。

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