沙棘不同组织部位的抗氧化活性研究

王晓飞， 李 辉，2， 刘铭佩*， 焦海胜

（1.兰州大学第二医院药学部，甘肃兰州730030；2.兰州大学药学院，甘肃兰州730000）



沙棘不同组织部位的抗氧化活性研究

王晓飞1， 李 辉1，2， 刘铭佩1*， 焦海胜1

（1.兰州大学第二医院药学部，甘肃兰州730030；2.兰州大学药学院，甘肃兰州730000）

摘要:目的 比较沙棘不同组织部位叶、茎和果实的抗氧化活性。方法 分别采用铜离子还原能力法（CUPRAC）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法测定沙棘叶、茎和果实的抗氧化活性，并比较其不同组织部位的抗氧化活性。结果 沙棘叶、茎和果实的DPPH自由基清除能力均低于没食子酸，其清除DPPH自由基的半数有效量（IC50）分别为217.8、350.5和739.2 μg/mL；沙棘叶、茎和果实的Cu2 +的还原能力Tro1ox当量（TEAC值）分别为0.146、0.133 和0.057 μg/mL。结论 沙棘叶、茎和果实均具有一定的抗氧化性，其抗氧化能力的强弱顺序为叶＞茎＞果实。

关键词:沙棘；DPPH；CUPRAC；抗氧化活性

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.046

随着分子生物学和医学的迅速发展，人们对生物体中包含的大量自由基反应及其对人体所产生的危害有了越来越多的认识。研究表明，保持机体自由基产生与消除的平衡，防止自由基对细胞和组织的损伤，是预防细胞活力下降、机体衰老、色素形成、血管病变、细胞癌变、糖尿病及并发症等80余种疾病的有效措施之一［1-3］。而减少机体氧化损伤的最有效方法是补充抗氧化剂。沙棘（HiPPoPhae rhamnoides Linn）又名醋柳、酸刺，为胡颓子科沙棘属的落叶灌木或小乔木，是蒙古族和藏族的惯用药材，具有止咳化痰、消食化滞、活血散瘀等功效［4］。我国沙棘资源丰富，占世界沙棘资源总面积的90％，广泛栽植于黄土高原及三北地区，用于减少水土流失、恢复植被、改善生态环境，具有很高的药用、生态和经济价值。沙棘叶、茎和果实中含有丰富的微量元素和百种生物活性物质［5］，研究证明，沙棘叶、茎和果实均具有抗氧化活性［6-11］。然而，由于抗氧化活性测定方法有多种，目前尚无标准的测定方法，其测定标准、单位表述不统一，关于沙棘叶、茎和果实的抗氧化活性数据之间不能有效的进行统计比较［12］。此外，由于沙棘叶、茎和果实化学成分的复杂性，不能只用一种方法测定其抗氧化活性，需要联合采用多种方法反映其抗氧化活性［12］。鉴于DPPH法中检测试剂DPPH自由基稳定易得［13］及CUPRAC法其检测环境接近于生理环境［14］，为了比较沙棘不同组织部位叶、茎和果实的抗氧化活性，本文分别采用铜离子还原能力法（CUPRAC）和DPPH法测定沙棘叶、茎和果实的抗氧化活性，并比较其不同组织部位的抗氧化活性。

1 材料与仪器

UV-2450型紫外分光光度仪（日本岛津公司），ME215S型吉尼斯系列电子分析天平（德国赛多利斯仪器有限公司），HX2002T电子天平（慈溪市天东衡器厂），MH-2000型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，美国Sigma公司，批号D9132），2，9-二甲基-1，10-菲啰啉（新亚铜灵，上海笛柏化学品技术有限公司，批号484-11-7），水溶性维生素E（Tro1ox，美国MPBiomedica1s公司，批号M5491），没食子酸（分析纯，上海中泰化学试剂有限公司，批号20130913），CuC12·2H2O（分析纯，天津市百世化工有限公司，批号20130224），醋酸铵（分析纯，天津市百世化工有限公司，批号20130221），95％乙醇（分析纯，宝鸡市康利工贸有限公司，批号20140409）。

沙棘叶、茎和果实采摘自甘肃省定西市渭源县，经中国科学院兰州化学物理研究所戚欢阳副研究员鉴定为胡颓子科沙棘属沙棘的叶、茎和果实。

2方法与结果

2.1 样品储备溶液的制备 取沙棘叶、茎和果实常温阴干，粉碎，分别称取沙棘叶、茎和果实粉末各3份，每份5 g，加入95％乙醇50 mL加热回流提取3次，每次1.5 h，提取液过滤合并，用95％的乙醇定容至250 mL，摇匀，作为样品储备溶液，置于4℃的冰箱中，备用。

2.2 样品抗氧化活性的DPPH法测定

2.2.1 DPPH溶液及阳性对照没食子酸溶液的制备 精密称取DPPH 8.32 mg，95％乙醇溶解，定容至250 mL，摇匀，避光置于4℃的冰箱中，备用；精密称取没食子酸11.58 mg，95％乙醇溶解，定容至100 mL，摇匀，精密量取上述溶液8 mL，95％乙醇定容至25 mL，作为阳性对照溶液，置于4℃的冰箱中，备用。

2.2.2 反应时间的优化 分别精密量取沙棘叶、茎及果实储备溶液6.5、10、8 mL，95％乙醇定容至25 m L，作为沙棘叶、茎及果实样品溶液，精密量取DPPH溶液4 mL，按表1依次加入样品溶液和95％乙醇，混合均匀后，于517 nm处每隔3 min测定其吸光度值，结果如图1所示。

表1　样品溶液和9 5％乙醇的加入量

图1　样品、阳性对照溶液与D P P H混合后不同时间点的吸光度

由图1可知，样品、阳性对照溶液与DPPH混合后，吸光度值随着时间推移变小，前6 min变化明显，之后变化渐渐缓慢，20 min后基本平稳。为了节约时间及便于比较，选择20 min为样品、阳性对照溶液与DPPH的适宜反应时间。

2.2.3 沙棘不同组织部位DPPH清除能力的测定 精密量取DPPH溶液4 mL，分别按表2依次加入样品和95％乙醇，混合均匀后，常温避光反应20 min，于517 nm处测定其吸光度值，平行测定3次。DPPH清除率按式（1）计算。

其中，A空白为4 mL DPPH溶液与1 mL 95％乙醇溶液混合后的吸光度值，A样品为4 mL DPPH溶液依次加入样品和95％乙醇反应20 min后的吸光度值。按式（1）计算其DPPH清除率，以质量浓度和DPPH清除率作图，其结果见图2，求得清除50％DPPH所需的质量浓度，即半数抑制浓度IC50值。

由图2可知，沙棘叶、茎、果实及没食子酸溶液分别在0～312、0～560、0～1 280及0～7.41 μg/mL之间与DPPH清除率线性相关，相关系数分别为0.999 5、0.991 1、0.996 2及0.999 0，根据线性方程计算沙棘叶、茎、果实及没食子酸的IC50值分别为217.8、350.5、739.2及6.11 μg/mL，其清除DPPH的能力强弱顺序为没食子酸﹥叶＞茎＞果实。

2.3 样品抗氧化活性的CUPRAC法测定

表2　样品溶液和9 5％乙醇的加入量

图2　不同质量浓度样品、阳性对照溶液的D P P H清除率

2.3.1 检测试剂及标准品溶液的制备 称取CuC12·2H2O 42.808 mg于250 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀；称取醋酸铵19.27 g于250 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀；称取新亚铜灵164.89 mg于100 mL的棕色量瓶中，加95％乙醇溶解并定容至刻度，摇匀。将配制好的溶液放置于4℃的冰箱中，备用。

精密称取Tro1ox 10.05 mg于25 mL的量瓶中，加95％乙醇溶解并定容至刻度，摇匀。置于4℃的冰箱中，备用。

2.3.2 反应时间的优化 分别精密量取沙棘叶、茎及果实储备溶液5 mL，95％乙醇定容至25 mL，作为沙棘叶、茎及果实样品溶液。精密量取新亚铜灵溶液1 mL、CuC12溶液1 mL及醋酸铵溶液1 mL，按表3依次加入样品溶液和95％乙醇，混合均匀后，于450 nm处每隔5 min测定其吸光度值，结果如图3所示。

表3　样品溶液和9 5％乙醇的加入量

图3　样品、标准品溶液与检测试剂混合后不同时间点的吸光度

由图3可知，样品溶液与检测试剂混合后，吸光度值随着时间推移增加，而标准品溶液与检测试剂混合后，吸光度值随着时间推移减少。前10 min变化明显，之后变化渐渐缓慢，30 min后基本平稳。为了节约时间及便于比较，选择30 min为样品、标准品溶液与检测试剂的适宜反应时间。

2.3.3 标准曲线的绘制 精密量取新亚铜灵溶液1 mL、CuC12溶液1 mL及醋酸铵溶液1 mL，分别加入Tro1ox溶液30、45、60、75、90、105 μL，混合均匀，95％乙醇补足4 mL，常温避光30 min后，于450 nm处测定其吸光度值。以吸光度A为纵坐标，以质量浓度C（μg/mL）为横坐标进行线性回归，其标准曲线见图4。结果表明，Tro1ox溶液在12.06～42.12 μg/mL之间与吸光度具有良好的线性相关，相关系数为0.9981。

图4　Tr o l o x标准曲线

2.3.4 沙棘叶不同部位Cu2 +的还原能力的测定 分别精密量沙棘叶、茎及果实样品溶液50、50、120 μL，按照2.3.3项的测定方法测定其吸光度值，将测量的吸光度值，代入标准曲线求得X，则样品的Cu2 +的还原能力Tro1ox当量（TEAC值）为X/C样品（即1 μg/mL的样品溶液相当的Tro1ox溶液），其中C样品表示样品溶液的质量浓度。结果表明，沙棘叶、茎和果实的Cu2 +的还原能力Tro1ox当量（TEAC值）分别为0.146、0.133和0.057 μg/mL。其Cu2 +的还原能力强弱顺序为叶＞茎＞果实。

3 讨论

虽然当前关于沙棘叶、茎及果实抗氧化活性的报道较多，但是由于缺乏标准的测定方法，其测定标准、单位表述不统一，尚不能对沙棘叶、茎及果实的抗氧化活性进行比较。此外，由于沙棘叶、茎和果实化学成分的复杂性，不能只用一种方法测定其抗氧化活性。用不同的抗氧化指标综合评价沙棘叶、茎和果实的抗氧化能力，有利于全面比较沙棘叶、茎和果实之间的差异。虽然DPPH法和CUPRAC法不能完全模拟体内过程，但是由于DPPH法中检测试剂DPPH自由基稳定易得［10］及CUPRAC法其检测环境接近于生理环境，本文采用DPPH法和CUPRAC法对沙棘叶、茎和果实的抗氧化活性进行检测。虽然采用DPPH法和CUPRAC法测定沙棘叶、茎和果实的抗氧化活性的结果不同，但通过比较可以发现其抗氧化能力的强弱顺序为叶＞茎＞果实。本研究结果为科学合理的利用沙棘资源提供了理论基础。

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*通信作者:刘铭佩（1967—），女，主任药师，主要从事药物新剂型、新技术的研究。Te1:（0931）8942571，E-mai1: 1iumingPei67 @163.com

作者简介:王晓飞（1982—），男，博士，从事天然药物化学研究。Te1:（0931）8942491，E-mai1: wxf_ 2511@163.com

基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金（1zujbky-2013-46）；兰州大学第二医院院内中医药项目（YJzy2013-14）

收稿日期:2015-04-22

中图分类号:R285.5

文献标志码:B

文章编号:1001-1528（2016）02-0437-04