肠道菌群法研究黄芪对防风中升麻素苷、5-0-甲基维斯阿米醇苷代谢的影响

刘 玲， 赵晓莉*， 狄留庆*， 李俊松

（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210046；2.江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心，江苏南京210046；3.江苏省儿童呼吸疾病［中医药］重点实验室，江苏南京210046）



肠道菌群法研究黄芪对防风中升麻素苷、5-0-甲基维斯阿米醇苷代谢的影响

刘 玲1，2，3， 赵晓莉1，2，3*， 狄留庆1，2，3*， 李俊松1，2，3

（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210046；2.江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心，江苏南京210046；3.江苏省儿童呼吸疾病［中医药］重点实验室，江苏南京210046）

摘要:目的 采用肠道菌群法研究黄芪对防风中主要活性成分升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷代谢的影响，从而探讨防风-黄芪药对的配伍机制。方法 采用肠道菌群法，比较不同时间点防风组和防风-黄芪组以及防风单体组和防风单体-黄芪组中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素的质量浓度。结果防风-黄芪组中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的质量浓度均高于防风组，升麻素的质量浓度均低于防风组。单体-黄芪组中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的质量浓度均高于单体组，升麻素的质量浓度均低于单体组。结论黄芪能抑制防风中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的水解反应，减缓其代谢。

关键词:升麻素苷；5-O-甲基维斯阿米醇苷；升麻素；肠道菌群

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.041

中药有效成分（尤其是分子结构中含葡糖苷类的成分）易受到肠道菌群的作用，发生结合、裂解等代谢转化，影响药物的体内吸收［1］。防风-黄芪为经典、优效药对［2］，其主要活性成分色原酮类、黄酮苷类均易在肠道菌群作用下分解成苷元［3］。本课题组前期研究表明，与单用防风组相比，防风-黄芪配伍组中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的AUC、Cmax、Tmax显著性提高，而升麻素的Cmax却显著性降低，提示黄芪对防风中主要活性成分的生物利用度产生显著影响［4］。本实验采用肠道菌群法研究黄芪对防风中主要活性成分升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷代谢的影响，从而探讨防风-黄芪药对的配伍机制。

1 材料

1.1 药材、对照品和试剂 黄芪、防风经鉴定合格；橙皮苷对照品（批号110721-201115，中国食品药品检定研究院）、升麻素苷对照品（批号111522-201008，中国食品药品检定研究院）、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（批号111523-201208，中国食品药品检定研究院）、升麻素对照品（批号111710-200501，中国食品药品检定研究院）供含量测定用；升麻素苷原料药、5-O-甲基维斯阿米醇苷原料药（南京泽郎医药科技有限公司，纯度为98％）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司），水为超纯水。

PBS溶液（PH 7.3）: 0.27g KH2PO4/L，1.42g Na2HPO4/L，8g NaC1/L，0.2g KC1/L。

缓冲盐溶液: 0.2 g CaC12/L，0.2 g MgSO4·7H2O/L，1 g K2HPO4·3H2O/L，1 g KH2PO4/L，10 g NaHCO3/L，2 g NaC1/L。

肠道菌厌氧培养液（PH 7.3）: 1 000 mL蒸馏水含10 g酵母浸膏、20 g胰蛋白胨、0.5 g半胱氨酸盐酸盐和40 mL缓冲盐溶液，120℃高压灭菌15 min，冷却后置4℃保存。1.2 实验动物 SD雄性大鼠，体质量220～250 g，清洁级，浙江省实验动物中心，合格证号: scxk（浙）2014-0001。

1.3 仪器 Waters 2695高效液相色谱系统；YXJ-Z型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；微量移液器（德国ePPendorf公司）；FA1204B型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 原料药的制备 取升麻素苷原料药适量，精密称定，加入蒸馏水超声溶解，定容后制得1.2 mg/mL的贮备液，置于4℃冰箱保存。按相同方法制备，制得1.8 mg/mL的5-O-甲基维斯阿米醇苷贮备液。

2.2 药液的提取 150 g防风，2次回流提取（第1次: 10倍量水，1.5 h。第2次: 8倍量水，1 h），合并滤液。将滤液减压浓缩，得1 g/mL防风药液。黄芪450 g，按相同方法制备，得3 g/mL黄芪药液。药液置于4℃冰箱，备用。

2.3 内标橙皮苷溶液的配制 取橙皮苷对照品适量，精密称定，加入甲醇超声溶解，定容后制得391 μg/mL的内标储备液，置于4℃冰箱保存。

2.4 肠道菌液的制备 取12只大鼠新鲜粪便，与4倍量的PBS溶液混合均匀，经纱布过滤所得液体离心（500 r/min，5 min），取上清液，加入9倍量厌氧培养液，置于37℃厌氧环境中培养12 h，使肠道菌充分生长，即为肠道菌液。

2.5 肠道菌群实验与样品处理方法 取肠道菌液160 μL，加入40 μL药液，置于37℃厌氧环境中孵育，分别于0、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、36和48 h取出，并加入1 mL冰甲醇溶液，终止肠菌代谢反应。涡旋3 min，离心（12 000 r/min，5 min），取上清液160 μL，加入40 μL内标，涡旋2 min，离心（12 000 r/min，5 min），取上清液10 μL，用液相色谱仪测定分析。

2.5.1 黄芪对防风提取液中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷代谢的影响 实验分为2组，各取肠道菌液160 μL，一组加入20 μL防风提取液及20 μL PBS溶液；另一组加入20 μL防风提取液及20 μL黄芪提取液。

2.5.2 黄芪对单体升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷代谢的影响 实验分为4组，各取肠道菌液160 μL，第1组加入20 μL升麻素苷溶液及20 μL PBS溶液，第2组加入20 μL升麻素苷溶液及20 μL黄芪提取液，第3组加入20 μL 5-O-甲基维斯阿米醇苷溶液及20 μL PBS溶液，第4组加入20 μL 5-O-甲基维斯阿米醇苷溶液及20 μL黄芪提取液。

2.6 样品中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素HPLC分析方法的建立

2.6.1 色谱条件 XBridgeTM C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温30°C；DAD检测器，检测波长254 nm；流动相A为水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序: 1～20 min，88％～65％ A；20～24 min，65％～65％ A；24～25 min，65％～88％ A；25～28 min，88％～88％ A；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。

2.6.2 方法学考察

2.6.2.1 专属性考察 取空白肠道菌孵育液、黄芪药液、加升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素及内标对照品的肠道菌孵育液和防风-黄芪组代谢2 h后的肠道菌孵育液，在“2.6.1”项色谱条件下，考察该方法的专属性，由图1可见，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素和内标能较好分离，样品中的其它成分在此条件下不干扰目标成分的测定。

1-升麻素苷 2-升麻素 3-5-O-甲基维斯阿米醇苷 4-内标图1　空白肠道菌孵育液（A），黄芪药液（B），加升麻素苷、5-0-甲基维斯阿米醇苷、升麻素及内标对照品的肠道菌孵育液（C）和防风-黄芪组代谢2 h后的肠道菌孵育液（D）的HPLC图

2.6.2.2 线性关系考察 分别取升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素对照品适量，精密称定，加入甲醇超声溶解，定容后制得升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素分别为240、480、240 μg/mL的混合对照品贮备液，再逐倍稀释成系列质量浓度的混合对照品溶液。按“2.5”项方法处理后进样测定。以升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素的质量浓度为横坐标，以升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素与内标的峰面积比值为纵坐标，进行加权最小二乘回归，结果见表1，表明升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和升麻素分别在3.75～240、7.5～480 和3.75～240 μg/mL具有良好的线性关系。

表1　3种成分的线性回归方程

2.6.2.3 绝对回收率和精密度考察 低、中、高质量浓度的升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和升麻素混合对照溶液（升麻素苷15、60、240 μg/mL；5-O-甲基维斯阿米醇苷30、120、480 μg/mL；升麻素15、60、240 μg/mL），平行5份，按“2.5”项方法处理后进样测定。结果见表2，表明升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和升麻素绝对回收率和精密度符合要求。

表2　3种成分的绝对回收率和精密度

2.6.2.4 稳定性考察 低、中、高质量浓度的升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和升麻素混合对照溶液（升麻素苷15、60、240 μg/mL；5-O-甲基维斯阿米醇苷30、120、480 μg/mL；升麻素15、60、240 μg/mL），按“2.5”项方法处理后进样测定，分别于0、12、24 h进样分析。结果表明，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和升麻素在24 h内的稳定性符合要求。

3实验结果

3.1 黄芪对防风主要活性成分代谢的影响 以时间为横坐标，以防风组、防风-黄芪组样品中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和升麻素的质量浓度为纵坐标，作图，结果见图2。用DAS 3.2.4软件处理数据，得出防风组、防风-黄芪组升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和升麻素的AUC0-t值，结果见表3。

表3　黄芪对防风主要活性成分代谢的影响

图2　防风组、防风-黄芪组的升麻素苷、5-0-甲基维斯阿米醇苷和升麻素的质量浓度-时间曲线

结果表明，与防风组相比，防风-黄芪组升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的质量浓度均提高，升麻素的质量浓度均降低；防风-黄芪组升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的AUC0-t值均显著性提高，升麻素的AUC0-t值有所降低。结果表明黄芪能抑制防风中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的水解反应。

3.2 黄芪对单体升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷代谢的影响 以时间为横坐标，以单体组、单体-黄芪组样品中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和升麻素的质量浓度为纵坐标，作图，结果见图3。用DAS 3.2.4软件处理数据，得出防风组、防风-黄芪组升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和升麻素的AUC0-t值，结果见表4。

结果表明，与升麻素苷组相比，升麻素苷-黄芪组升麻素苷的质量浓度均提高，升麻素的质量浓度均降低，升麻素苷的AUC0-t值显著性提高，升麻素的AUC0-t值显著性降低。与5-O-甲基维斯阿米醇苷组相比，5-O-甲基维斯阿米醇苷-黄芪组5-O-甲基维斯阿米醇苷的质量浓度均提高，AUC0-t值显著性提高。进一步证明了黄芪能抑制单体升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的水解反应。

图3　单体组、单体-黄芪组的升麻素苷、5-0-甲基维斯阿米醇苷和升麻素的质量浓度-时间曲线

表4　黄芪对单体升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷代谢的影响

4 讨论

肠道菌群对含糖苷键的药物进行水解反应，是中药成分在肠道产生代谢的最主要方式之一［5］，黄芪、防风中含有大量黄酮苷、色原酮类成分，易在肠道菌群的作用下代谢为苷元。本实验比较了不同时间点防风组和防风-黄芪组以及防风单体组和防风单体-黄芪组升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素的质量浓度。结果发现，防风-黄芪组中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的质量浓度均高于防风组，升麻素的质量浓度均低于防风组。单体-黄芪组中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的质量浓度均高于单体组，升麻素的质量浓度均低于单体组。结果表明黄芪能抑制防风中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的水解反应，减缓其代谢。黄芪含有皂苷、黄酮、黄芪多糖等成分，这些成分多数具有葡糖苷键结构［6］，与防风配伍应用时，可能对防风中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的代谢产生一定程度的竞争性抑制作用。

国内外文献研究表明［7-10］，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷及其苷元均具有抗炎、退热、镇痛及抗血小板聚集等作用，且苷的药理活性作用研究报导更多。文献还报道防风提取液在体内的入血成分既有苷又有苷元，所以防风发挥药效是苷和苷元的共同作用。抑制苷类代谢为苷元，对苷而言是正向指标，对苷元是负向指标，对防风整体而言，苷和苷元均对药效的发挥产生贡献，但各自贡献率的大小则有待深入研究。中药及其复方药效的发挥是其所含多类化学成分综合作用的结果，本实验针对前期药对配伍后主要活性成分药动学参数的变化特征，选择在肠道代谢环节开展系列研究，最终得出黄芪对防风中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的代谢产生一定程度的竞争性抑制作用这一实验结论，这较好地解释防风-黄芪药对中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷在大鼠体内AUC、Cmax、Tmax提高，升麻素在大鼠体内Cmax降低这一现象，从生物药剂学角度揭示了防风-黄芪药对配伍应用的科学内涵。

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*通信作者:赵晓莉（1976—），女，博士，从事中药新剂型新技术应用与评价研究。Te1:（025）85811230，E-mai1: x1ee_ zhao@ 163.com

作者简介:刘 玲（1990—），女，硕士生，从事中药新剂型新技术应用与评价研究。E-mai1: 15005177886@163.com

基金项目:国家自然科学基金青年基金项目（81102825）

收稿日期:2014-09-29

中图分类号:R966

文献标志码:B

文章编号:1001-1528（2016）02-0421-05