砂仁挥发油GC-MS指纹图谱与其镇痛作用的关系

李生茂， 叶 强， 敖 慧*

（1.川北医学院药学院，四川南充637000；2.成都中医药大学，四川成都611137）



砂仁挥发油GC-MS指纹图谱与其镇痛作用的关系

李生茂1， 叶 强2， 敖 慧2*

（1.川北医学院药学院，四川南充637000；2.成都中医药大学，四川成都611137）

摘要:目的 研究砂仁Amomi Fructus挥发油GC-MS指纹图谱与其镇痛作用的关系。方法 GC-MS法建立18批不同产地砂仁挥发油的指纹图谱，醋酸致小鼠扭体实验研究其镇痛作用，灰色关联度法研究谱效关系。结果 GC-MS指纹图谱中有7个共有峰，与挥发油的镇痛作用有一定关联（0.858～0.718），大小依次为樟脑＞乙酸龙脑酯＞龙脑＞匙叶桉油烯＞D-柠檬烯＞莰烯＞月桂烯。结论 砂仁挥发油的镇痛作用为多组分联合效应的结果。

关键词:砂仁；挥发油；GC-MS指纹图谱；镇痛作用；灰色关联度

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.025

KEY W 0RDS: Amomi Fructus；essentia1oi1；GC-MS fingerPrints；ana1gesia effect；grey corre1ation

砂仁为姜科植物阳春砂Amomum villosum Lour.、绿壳砂Amomum villosum Lour.Var.xanthioides T.L.Wu et Senjen或海南砂Amomum longiligulare T.L.Wu的干燥成熟果实［1］，其主要药效部位是挥发油，具有抗溃疡、抗炎、镇痛、止泻、抗菌等广泛的药理作用［2］。其中，乙酸龙脑酯、樟脑、莰烯、柠檬烯和龙脑等为砂仁挥发油的主要组成部分［3-4］，并以乙酸龙脑酯的含有量最高，抗炎镇痛等活性较显著［5-6］，为砂仁药材的质控成分［1］，而其它几种主要成分是否也起到相关作用目前尚不清楚。同时，目前对砂仁挥发油的研究大多为化学成分指纹图谱分析或药效学实验，而对其药效作用与化学物质基础的整体性、联系性探索较少。本课题组前期对不同品种砂仁的抗炎活性进行比较，并研究其物质基础，发现该活性与龙脑、芳樟醇、乙酸龙脑酯等多种成分关系密切。本实验进一步对砂仁挥发油GC-MS指纹图谱及其镇痛作用进行了研究，并采用灰色关联度分析法考察其化学信息谱与镇痛作用的关系，以期初步揭示砂仁挥发油的镇痛物质基础，并为进一步控制该药材的质量提供一定依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agi1ent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪，包括Agi1ent GC-MSD工作站（美国安捷伦公司）；Sartorius BP211D AG电子天平（德国赛多利斯公司）；轻油提取器（四川蜀牛玻璃仪器有限公司）。

1.2 试药 18批砂仁药材经成都中医药大学中药资源与鉴定系陈璐讲师鉴定，确认为阳春砂Amomum villosum Lour.或绿壳砂Amomum villosum Lour.var.xauthioides T.L.Wu et Senjen的干燥成熟果实，具体见表1。羧甲基纤维素钠（西安惠安纤维素化工有限公司，批号20130416）；正己烷（国药集团化学试剂有限公司，批号T20100928）；无水硫酸钠（国药集团化学试剂有限公司，批号20140114）；冰醋酸（成都市科龙化工试剂厂，批号20100826）均为分析纯；水为蒸馏水。

表1　砂仁来源Tab.1 Sources of Amom i Fructus

1.3 动物 SPF级昆明种小鼠200只，雌雄各半，许可证号SCXK（川）2008-11，体质量18～22 g，由成都中医药大学动物中心提供。

2 方法与结果

2.1 砂仁挥发油镇痛作用研究

2.1.1 样品制备 将各批次砂仁药材粉碎，过20目筛，称取10 g，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加入30倍量（300 mL）水，按《中国药典》2010年版一部挥发油测定法（附录XD甲法）提取挥发油，水蒸汽蒸馏5 h，收集挥发油（均呈淡黄色、油状），0.5％羧甲基纤维素钠混悬，配制成相当于生药125 g/L的药液，备用。

2.1.2 实验方法 参考文献［7］，取小鼠200只，随机分为20组，每组10只，分别为模型组、阳性药组和18个给药组。阳性药组（62.5 mg/L盐酸吗啡水溶液）及各给药组按0.4 mL/10 g剂量灌胃给予相应药液，模型组灌胃给予相应体积的生理盐水，每天1次，连续3 d。最后一次给药0.5 h后，腹腔注射0.6％冰醋酸（0.2 mL/10 g，临用前配制），记录各组小鼠给药后20 min内扭体（腹部收缩内凹、仲展后肢、臀部抬高、蠕行）的次数，计算镇痛率，公式为镇痛率=（模型组扭体次数-给药组扭体次数）/模型组扭体次数×100％

2.1.4 实验结果 与模型组比较，18批砂仁挥发油均有不同程度的镇痛作用，其中S3、S4、S5、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S16和S17比较明显（P＜0.01或0.05），见表2。

2.2 砂仁挥发油GC-MS指纹图谱

2.2.1 样品制备 按“2.1.1”项下方法制备砂仁挥发油，加正己烷1 mL稀释，无水硫酸钠除去水分，微孔滤膜过滤，GC-MS分析。

2.2.2 气相色谱-质谱联用分析 GC条件:载气为氦气；体积流量1.0℃/min；程序升温，初始温度60℃，4℃/min速率升至124℃，8℃/min速率升至196℃，保持5 min，10℃/min速率上升至260℃，保持5 min；分流进样，分流比1∶60；进样量1 μL；进样口温度250℃。MS条件: EI电离；电子能量70 eV；离子源温度220℃；全扫描方式。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取S1样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.2”项色谱条件下连续进样6次，测定GC-MS色谱图。结果，各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于5％，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取S1样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定GC-MS色谱图。结果，各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于5％，表明溶液在24 h内稳定。

表2　砂仁挥发油镇痛实验结果（±s，n=1 0）Tab.2 Results of tests for the analgesla effect of essentlal oll from Amom i Fructus（±s，n=10）

表2　砂仁挥发油镇痛实验结果（±s，n=1 0）Tab.2 Results of tests for the analgesla effect of essentlal oll from Amom i Fructus（±s，n=10）

注:与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别　　扭体次数　　镇痛率/％模型组32.6±5.42　-阳性药组　0　100 S1　23.6±8.15*　27.61 S2　29.0±9.84　11.04 S3　27.0±5.08　17.18 S4　23.6±8.40*　27.61 S5　25.1±10.49*　23.01 S6　22.9±10.58**　29.75 S7　27.8±6.03　14.72 S8　24.5±9.28*　24.85 S9　19.9±5.63**　38.96 S10　20.4±8.81**　37.42 S11　18.6±9.77**　42.94 S12　17.7±9.06**　45.71 S13　22.7±9.77**　30.37 S14　21.6±10.74**　33.74 S15　27.5±8.40　15.64 S16　21.1±6.44**　35.27 S17　24.8±7.54*　23.93 S18　30.4±6.87　6.75

2.3.3 重复性试验 取S1样品，按“2.2.1”项下方法平行制备5份供试品溶液，测定GC-MS色谱图。结果，各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于5％，表明该方法重复性良好。

2.4 指纹图谱建立、分析及评价

2.4.1 测定与结果 取“2.2.1”项下制备的样品，在“2.2.2”项色谱条件下分别进行GC-MS分析，测得18批砂仁挥发油的色谱图，确定其中7个色谱峰为共有峰，其峰面积之和均占各样品总峰面积的73.93％～97.00％，可较好地代表该样品。进一步通过NIST08质谱数据系统检索，并与标准图谱比较分析，鉴定了共有色谱峰所代表的成分，结果见表3、图1。

2.4.2 相对度分析 以S1广东蟠龙的阳春砂仁为参照，采用Agi1ent GC-MSD工作站自带的相似度分析软件处理，得到18批砂仁药材GC-MS指纹图谱间的相似度。结果显示，与S1比较，砂仁各样品之间的相似度差异较大（0.338～0.983），见图2。

表3　GC-MS指纹图谱共有峰峰面积Tab.3 Peak areas of comm on peaks of GC-MS flngerprlnts

2.5 灰色关联度分析 对18批砂仁挥发油GC-MS指纹图谱共有峰峰面积的数据与镇痛活性进行灰色关联度分析，研究两者之间的相关性。将不同批次砂仁挥发油的镇痛药效设为参考序列（母序列），7个共有峰设为比较序列（子序列），1～7个共有峰分别用x1～x7表示。参考文献［8-10］的方法和步骤。

2.5.1 绝对差序列 采用均值化变换，即分别求出各个序列数据的平均值，再用其去除对应序列中各个原始数据，所得到的商为新的数据列，即均值化数列。经数据变换的母序列标记为{Yo（m）}，子序列记为{Yi（m）}，绝对差序列Δoi（m）= ∣Yo（m）-Yi（m）∣（1≤i≤m）

图1　不同产地砂仁挥发油GC-MS指纹图谱Flg.1 GC-M S flngerprlnts of essentlal oll from Amom i Fructus from dlfferent grow lng areas

图2　不同产地砂仁挥发油GC-MS指纹图谱相似度Flg.2 Slm llarltles of GC-MS flngerprlnts of essentlal oll from Amomi Fructus from d lfferent grow lng areas

2.5.2 关联系数 关联系数反映2个被比较序列的靠近程度。母序列与子序列的关联系数记为Loi（k），Δmin和Δmax分别表示所有比较序列绝对差中的最小值与最大值；ρ为分辨系数，其意义是削弱最大绝对差数值太大所引起的失真现象，提高关联系数之间的差异显著性，取值在0～1之间，本实验选取0.5。另外，关联系数反映2个被比较序列的靠近程度。计算公式如下。

2.5.3 关联度 关联度按两个比较序列的关联系数均值计算。roi为子序列i与母序列o的关联度，N为比较序列的数据个数。公式为roi=

2.5.4 关联序 将m个子序列对同一母序列的关联度按大小顺序排列，即为关联序，记为（x），它直接反映各个子序列对母序列的“贡献”大小。据此，可寻找指纹特征峰对应的化学成分与药效间的联系。

2.5.5 谱效相关性分析 对砂仁挥发油指纹图谱中各共有峰峰面积的数据与镇痛活性进行灰色关联度及关联序分析。依据相对关联度的大小，确定各成分对镇痛作用的贡献顺序依次为x4＞x6＞x5＞x7＞x3＞x1＞x2，见表4。

表4　砂仁挥发油GC-MS图谱与镇痛作用的关系Tab.4 Relatlshlp between the GC-MS flngerprlnts of essentlal oll from Amomi Fructus and lts analgesla effect

3 讨论

中药的药效物质基础具有整体性、模糊性的特征，是有效物质群综合作用的结果［9］，但因其所含成分复杂，故研究和表征难度很大，对其中部分指标成分的控制也难以真正评价其药效与质量。中药指纹图谱可较全面地反映其所含化学成分的数量与含有量，但其表征的化学成分是否为药效成分以及与药效的相关程度不明确，难以体现两者之间的关系［11-12］。近年来，通过将指纹图谱与药效评价相结合，研究两者之间的相关性（即谱效关系）来寻找其药效相关化学物质基础，已逐渐成为探索中药特定药效物质基础的主要方法和解决中药质控指标与药效研究脱节问题的有效手段［13］。灰色关联度分析法作为对模糊系统研究的有效手段，适用于系统的信息量较少，但涉及的因素较多，而且这些因素往往相互影响、相互作用［14］，是构建谱效关系的常用分析方法之一，在相关研究中被广泛运用［15-16］。

砂仁为中医临床常用药，以广东阳春县产阳春砂的质量为最佳，尤以蟠龙山产者为第一，为道地产区［17］，研究显示，挥发油是其主要药效部位之一。本实验采用GC-MS，对18批砂仁挥发油进行了分析，建立了指纹图谱，确定其中7个色谱峰为共有峰，并明确其所代表的化学成分，各共有峰峰面积之和占总峰面积的73.93％～97.00％之间，可较好地表达该样品所含的化学成分信息。进一步以蟠龙山产阳春砂样品为基准，进行相似度研究，发现18批砂仁GC-MS指纹图谱之间相似度较差，表明以挥发油为指标时，各砂仁样品间的质量一致性较差，而且与品种、产地等因素无明显相关性。

然后，采用灰色关联度分析法研究了共有色谱峰与镇痛活性之间的关系，发现两者均有不同程度的关联度（0.858～0.718）。其中，樟脑、乙酸龙脑酯与砂仁的镇痛药效关联度较强，在0.800以上，为砂仁挥发油发挥镇痛作用的重要物质基础，另外龙脑、匙叶桉油烯醇和D-柠檬烯也有较高的关联度，在0.750以上，这与文献报道乙酸龙脑酯［18］、樟脑［19］、柠檬烯［20］和龙脑［21］具有镇痛作用的研究结果一致。综上所述，砂仁挥发油的镇痛作用不仅是其中主要化学成分乙酸龙脑酯发挥功效，还受其它成分的影响，是多组分联合效应的结果，但这些成分在砂仁镇痛的过程中究竟起到了何种作用（简单加和?相互协同?）还有待于作进一步的考察。结合前期研究发现，砂仁镇痛活性的相关成分同时也具有抗炎活性，但与两种药理作用关系的密切程度有差异，故有必要在结合活性评价的结果，并明确其与砂仁主要功效关系密切程度的基础上，引入多个指标，以更好地控制砂仁药材的质量。

参考文献:

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典: 2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010: 253.

［2］ 张明发，沈雅琴.砂仁临床药理作用的研究进展［J］.抗感染药学，2013，10（1）: 8-13.

［3］ 付 琛，周日水，周光雄.不同产地品种阳春砂仁挥发油化学成分的气相色谱-质谱联用分析［J］.时珍国医国药，2010，21（10）: 2534-2536.

［4］ 赵 锦，董 志，朱 毅，等.海南砂仁挥发油抗炎镇痛止泻的实验研究［J］.中成药，2009，31（7）: 1010-1014.

［5］ 叶 强，李生茂，敖 慧，等.不同产地绿壳砂仁挥发油组分比较［J］.中成药，2014，35（5）: 1033-1037.

［6］ 陈 璐，敖 慧，叶 强，等.阳春砂仁不同部位挥发油成分的GC-MS分析［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20 （14）: 65-68.

［7］ 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2001: 883.

［8］ 于 萍，李 克.使用Microsoft Exce1进行数据的灰关联分析［J］.微型电脑应用，2011，27（3）: 29-37.

［9］ 朱诗塔，雷 鹏，李新中，等.掌叶大黄不同炮制品指纹图谱与其止血作用的灰关联度分析［J］.中南药学，2009，7（1）: 55-58.

［10］ 石俊英，张会敏，王 颖，等.山东道地药材金银花HPLC指纹图谱研究［J］.山东中医药大学学报，2008，32 （1）: 69-73.

［11］ 霍仕霞，康雨彤，彭晓明，等.高良姜提取物促进黑素生成的谱效关系分析［J］.中草药，2013，44（8）: 995-1002.

［12］ 刘 莉，李文兰，丁晶鑫.基于“谱-效”相关的中药药效物质基础研究方法［J］.天然产物研究与开发，2013，25 （3）: 410-415.

［13］ 罗国安，王义民，曹 进，等.建立我国现代中药质量标准体系的研究［J］.世界科学技术:中医药现代化，2002，4（4）: 5-11.

［14］ 曾建红，莫炫永，戴 平，等.广西莪术挥发油抗肿瘤作用的谱效关系研究［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18 （13）: 91-94.

［15］ 秦昆明，郑礼娟，沈保家，等.谱效关系在中药研究中的应用及相关思考［J］.中国中药杂志，2013，38（1）: 26-31.

［16］ 陈华国，周 欣，赵 超，等.马兰草抗炎活性部位量效关系及高效液相色谱-效关系研究［J］.中国药学杂志，2013，48（14）: 1190-1193.

［17］ 陈彩英，詹若挺，王小平.砂仁品种、种质资源的考证溯源［J］.山东中医药大学学报，2011，35（4）: 354-357.

［18］ 吴晓松，李晓光，肖 飞，等.砂仁挥发油中乙酸龙脑酯镇痛抗炎作用的研究［J］.中药材，2004，27（6）: 438-439.

［19］ 熊 颖，吴雪茹，涂兴明，等.樟脑的药学研究进展［J］.检验医学与临床，2009，6（12）: 999-1001.

［20］ 王梅兰，林建交，陈雅容.柠檬烯对小白鼠中枢神经系统的影响［J］.海峡药学，2005，17（4）: 30-32.

［21］ 江光池，冯旭军，黄 岚，等.龙脑和异龙脑对小鼠和家兔的药理作用［J］.华西药学杂志，1989，4（1）: 23-25.

Relatlonshlp between the GC-MS flngerprlnts of essentlal oll from Amom i Fructus and lts analgesla effect

LISheng-mao1， YE Qiang2， AO Hui2 *
（1.School of Pharmacy，North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，China；2.Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China）

ABSTRACT:AIM To study the re1ationshiP between the gas chromatograPhy-mass sPectrometry（GC-MS）fingerPrints of essentia1oi1 from Amomi Fructus and its ana1gesia effect.METH0DS The fingerPrints of eighteen batches of essentia1oi1 from Amomi Fructus from different growing areaswere estab1ished by GC-MS.The ana1gesia effectwas tested by frequency body torsion caused by acetic acid in mice.The re1ationshiP between fingerPrints and ana1gesia effectwas ana1yzed by grey corre1ation.RESULTS There were seven common Peaks in GC-MS finger-Prints.A11 the common Peaks had a certain corre1ation with the ana1gesia effect（0.858 -0.718）with the rank of camPhor＞borny1acetate＞borneo1＞sPathu1eno1＞D-1imonene＞camPhene＞myrcene.C0 NCLUSI0 N The ana1gesia effect of essentia1oi1 from Amomi Fructus is the resu1t ofmu1ticomPonent combined effect.

*通信作者:敖 慧（1980—），女，博士，高级实验师，从事中药药理与中药质量控制研究。Te1:（028）61800192，E-mai1: aohui2005 @126.com

作者简介:李生茂（1981—），男，博士，讲师，从事中药药效物质基础及质量标准化研究。Te1:（0817）3300337，E-mai1: 1sm9110 @163.com

基金项目:成都中医药大学科技发展基金项目（ZRVI5201271）；成都中医药大学实验技术项目（13117）；四川省中医药管理局青年中医药课题（2014K090）

收稿日期:2015-06-08

中图分类号:R284.1

文献标志码:A

文章编号:1001-1528（2016）02-0346-05