茜素黄R与DNA的相互作用

欧亮龙,马 越,王兴明

(1.洛阳轴承研究所有限公司,河南 洛阳 471039;2.洛阳轴研科技股份有限公司,河南 洛阳 471039;

3.西南科技大学 材料科学与工程学院化学系,四川　绵阳 621010)



茜素黄R与DNA的相互作用

欧亮龙1,马 越2,王兴明3

(1.洛阳轴承研究所有限公司,河南 洛阳 471039;2.洛阳轴研科技股份有限公司,河南 洛阳 471039;

3.西南科技大学 材料科学与工程学院化学系,四川绵阳 621010)

摘要：通过紫外、荧光光谱法、热力学方法、粘度法等研究了有机小分子茜素黄R(AYR)与鲱鱼精DNA(hsDNA)作用的摩尔比，作用方式，结合常数，热力学参数等.研究结果表明，AYR与DNA的作用摩尔比为4∶1，结合常数K293.65K= 8.63×104 L·mol-1；AYR与DNA的作用模式为静电作用并且同时存在部分嵌插作用，通过热力学实验，结果表明AYR与DNA能够自发进行作用，并且为熵-焓协同驱动.

关键词：茜素黄R； 鲱鱼精DNA； 作用机理

茜素黄R (Alizarin Yellow R, 简称 AYR)是从一类茜草植物中发现的染料，一些功能性的医药和保健食品中常常会添加.[1]茜素黄 R 是一种茜草类有机小分子植物染料，研究发现这种小分子能够作为生物探针，通过这种探针可以探索和发现蛋白质的结构也可以深入了解蛋白质的生物功能从而研究两者之间的联系[2].本文研究茜素黄R与 DNA的相互作用方式，在新型抗癌药物的选择、抗癌功能的缓释改良以及抗病毒作用机理等方面有重要应用和理论意义.

1实验部分

1.1试剂与仪器

鲱鱼精DNA(hsDNA)，Sigma公司；茜素黄R(Alizarin Yellow R)，成都科龙化工试剂厂；三羟甲基氨基甲烷(Tris)，成都科龙化工试剂厂；吖啶橙(AO)，中国医药(集团)上海化学试剂公司.

UV-2102-PCS型紫外可见分光光度计，上海尤尼科有限公司；FL-4500型荧光光谱仪，日本日立公司；乌式贝德粘度计，上海市青浦县前明玻璃仪器厂；pHS-2C型酸度计，成都方舟科技开发公司.

1.2Tris-HCl生物缓冲溶液的配制

称取24.225 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入约2000 mL的二次蒸馏水，将事先校正好的pHS-2C型酸度计的复合电极插入Tris溶液中，缓慢加入由16.65 mL浓盐酸加适量水稀释后的稀盐酸，不断搅拌，直到酸度计指示pH值显示为7.40并且稳定，将配好的Tris-HC1缓冲溶液装入瓶中备用.

2结果与讨论

2.1紫外可见光谱法测定AYR与DNA相互作用的摩尔比

AYR与DNA作用的结合比是用摩尔比法来测试的，测试结果如图1所示.由图1可以看出，随着AYR溶液的加入，体系在210 nm处的吸收峰出现了规律性的增强.说明DNA与AYR发生了相互作用.这在265 nm处和380 nm处的两个相对较弱的紫外可见吸收峰也同样的出现了一定范围内的增强.这可能是因为AYR与DNA之间静电作用而引起的[3].通过图1中的延长线交点，通过计算该点位置上AYR与DNA的摩尔比，结果为3.94∶1≈4∶1，所以认为AYR与DNA作用的摩尔比为：nAYR∶nDNA= 4∶1.

2.2AYR与DNA相互作用的热力学计算

AYR与DNA的结合常数是通过双倒数法来计算的，通过吸光度反映各个组份的浓度来计算反应平衡常数.公式(1)中的A为吸光度，A0为未加入AYR时的吸光度，K是结合常数，可用下关系式式来描述[4]：

(1)

把式(1)分别代入293.65 K和310.15 K时测定的吸光度值，得到两条直线，通过对两条直线分别进行线性回归，即为双倒数图2.

图1　DNA和AYR作用的摩尔比(263nm)　　　　　　　　　　　　　　　图2　双倒数法　Fig.1　Molar ratio plots of DNA and Alizarin Yellow R(263nm)　　　　 Fig.2　Double reciprocal method(pH=7.40,293.65K,310.15K)　　　　cAYR=1.50×10-4mol/L;cDNA=8.00×10-7mol/L　　　　　　　　cAYR=1.50×10-4mol/L;cDNA=8.00×10-7mol/L

根据上述公式计算得到DNA与AYR的结合常数K293.65K=8.63×104L·mol-1和K310.15K=5.72×104L·mol-1，AYR与DNA相互作用的热力学相关参数可以根据以下热力学公式[5]进行：

(2)

(3)

(4)

由于温度改变不大，所以近似认为焓不随着温度的变化而改变.再根据公式(2)到(4)计算得出：ΔrHm= -1.89×104J·mol-1，ΔrGm,293.65K= -2.77×104J·mol-1，ΔrSm,293.65K=30.1 J·mol-1·K-1，结果显示ΔrGm< 0，这表明茜素黄R与DNA之间的相互作用是可以自发的进行；ΔrHm< 0，这就表明茜素黄R与DNA之间的相互作用为一个放热的过程，又因为ΔrSmθ>0，所以该反应是由焓和熵共同驱动的[6-7].

2.3磷酸盐对AYR的影响

由于DNA外部的磷酸骨架上含有大量带有负电荷的磷酸基，这些磷酸基使得DNA在水环境中自由的舒展成线状，所以用含有大量磷酸根离子的溶液与茜素黄R作用就有助于了解茜素黄R与DNA之间是否有静电相互作用.本实验用的是Na2HPO4.实验结果如图3所示.

通过磷酸盐实验可以看出，体系的吸收光谱在210 nm附近吸光度出现了一定的增加，故而AYR与DNA之间存在有静电作用[8].

2.4荧光探针法研究AYR与DNA的相互作用

吖啶橙(AO)被广泛用于生物光谱学的相关研究，它是一种偏碱性的染料，能够与双链DNA分子间的碱基以经典嵌插的方式发生作用，这种相互作用能够使AO的荧光强度发生极大的提高，因此AO可以被用作为DNA分子的荧光探针[9-11].将AYR加入到AO-DNA体系中，测试结果见图4，我们可以发现，体系测得的荧光值随着AYR的加入，出现了小幅度的降低现象.这是因为体系中的AYR与嵌插在DNA分子中的AO发生了竞争的相互作用，说明AYR与DNA之间存在嵌插作用.

图3　磷酸盐对AYR影响的紫外吸收光谱　　　　　　　　　图4　AYR对AO-DNA体系荧光光谱影响Fig.3 Influence of phosphate to UV-Vis absorption spectra of AYR(pH7.40)　　　Fig.4 The fluorescence spectra curve of the ARY to AO-DNA　　　cAYR=1.50×10-5mol/L;cNa2HPO4=1.00×10-3mol/L　　　　　　　　　cAO-DNA=1.20×10-5mol/L;cAYR=1×10-4mol/L

2.5AYR与DNA相互作用的Scatchard法研究

Scatchard法是用AO与DNA的嵌插复合物为基体，加入AYR后使其发生竞争，并且通过改变体系的离子强度，然后通过体系荧光光谱的变化来辨别AYR与DNA的作用方式的方法，Scatchard方程[12]可以用来解释吖啶橙与DNA的反应特性：

(5)

公式(5)其中，r代表的是每个核苷酸所结合的AO分子的个数、n则代表了核苷酸所能够结合的AO分子的最大取值、c代表了测试溶液中AO的即时浓度(即每次加入AO后所换算出的AO浓度)、K代表每个结合位点固有的结合常数.根据Scatchard方法，以r/c对r作图，将所得点进行线性回归，得到的直线方程的K值和n值见表1，根据表1可看出不管NaCl存在与否，Scatchard方程中的K值和n值均不相等，所以可以判断AYR与DNA是混合作用方式，即存在嵌插和非嵌插作用，这个结果与之前的磷酸盐和荧光探针分析得到的结果一致.

表1　茜素黄R与DNA相互作用的Scatchard方程

2.6粘度法分析AYR与DNA相互作用

图5　ARY对DNA粘度的影响Fig.5　Effect of viscosity of ARY on DNAcDNA=1.20×10-5mol/L

根据实验结果作图5，如图所示，粘度降低，这是茜素黄R与DNA分子以部分嵌插的方式相互作用的结果.以部分嵌插的方式发生相互作用的时候，DNA分子电荷失衡，分子扭曲变形，不再是长链，则粘度下降[13].

3结论

本文主要研究了AYR与DNA的直接作用，研究结果显示AYR与DNA相互作用的摩尔比为4∶1；相互作用的热力学参数分别为：ΔrHmθ= -1.89×104J·mol-1，ΔrGm,293.65K= -2.77×104J·mol-1，ΔrSθm,293.65K=30.1 J·mol-1·K-1，说明AYR与DNA的相互作用能够自发的进行，为熵和焓共同驱动；作用类型为静电和部分嵌插相互作用.

参考文献：

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[责任编辑：徐明忠]

Interaction between alizarin yellow R and DNA

OU Lianglong1,MA Yue2,WANG Xingming3

(1.Luoyang Bearing Research Institute, Luoyang 471039, China; 2.Luoyang Bearing Science&Technology Co.,Ltd.,Luoyang 471039, China; 3.Department of Chemistry, School of Materials Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China)

Abstract:In this paper, we study on the molar ratio, mode of action, binding constant sand thermodynamic parameter of the interaction of herring sperm DNA (hsDNA) with small organic molecules(Alizarin yellow R).The interaction has been investigated by UV spectroscopy, fluorescence spectroscopy, thermodynamics, viscosity, etc.The results show that the molar ratio of AYR and DNA is 4∶1, the binding constants is K293.65K= 8.63×104 L·mol-1.The action type of AYR and DNA is Static and partial intercalation, both interactions can occur spontaneously and is driven by entropy and enthalpy.

Key words:alizarin yellow R; herring sperm DNA; mechanism

中图分类号：O629.74

文献标识码：A

文章编号：1672-3600(2016)03-0040-04

作者简介:欧亮龙(1988-), 男, 洛阳轴承研究所有限公司助理工程师, 硕士,主要从事分析化学方向的研究.

收稿日期：2015-07-20