诱导多能干细胞的制备及其应用进展

张爱珍，温宗壮，姜文杰，宗文，高建刚，赵晶

(山东大学生命科学学院，济南250100)



诱导多能干细胞的制备及其应用进展

张爱珍，温宗壮，姜文杰，宗文，高建刚，赵晶

(山东大学生命科学学院，济南250100)

摘要：本文介绍了诱导多能干细胞(iPS)制备、来源，外周血诱导制备iPS的优势，iPS在人类疾病模型、再生医学和药物研发领域的应用，以及目前iPS研究存在的问题。认为iPS的产生是生命科学研究的重要成果，未来iPS技术的不断完善对临床多种疾病的治疗有重要意义。

关键词：诱导多能干细胞；胚胎干细胞；外周血细胞；疾病模型；再生医学；药物研发

全能干细胞是指一类具有潜在的分化成不同种类细胞(如肌细胞、神经细胞甚至是生殖细胞)能力的细胞。胚胎干细胞(ES)是一类来源于囊胚期内细胞团的全能性细胞，可以产生任意类型的细胞来满足不同的应用需求。然而，由于细胞来源的伦理问题和细胞治疗中免疫排斥反应，人类ES的研究和临床应用受到限制。2006年，有研究者[1]通过过表达几种转录因子得到了诱导多能性干细胞(iPS)。iPS没有伦理上的争论，具有跟ES相同的自我更新和多能性，故此项研究获得2012年诺贝尔医学生理学奖。本文就iPS的发展和其在药理学和医学上的应用综述如下。

1iPS的制备及来源

2006年，有研究者[1]选取了24种ES中重要的转录因子基因作为重编程候选因子。这些候选因子的不同组合按顺序导入小鼠胚胎成纤维细胞，通过Fbx15-Neo表达系统来筛选适当的重编程因子。如果这些候选基因能够重编程这些成纤维细胞，具有G418抗性的干细胞样克隆大约在2周后出现。最后，这24个候选因子缩小到4个转录因子。导入Oct3/4、Sox2、Klf4 和 c-Myc后，小鼠胚胎成纤维细胞被重编程为具有ES特征的细胞，这些细胞称为iPS[2]。2007年，Takahashi和Yu分别将人类体细胞重编程为iPS。 前者使用了Oct3/4、Sox2、Klf4以及c-Myc 四种因子[3]，而后者则使用了Oct3/4、Sox2,、Nanog和Lin28四种因子[4]。两项研究均表明人类iPS与ES在形态、增殖、多能性标记物、基因表达谱、表观遗传和分化潜能等很多方面相似。这些发现显示人类iPS可以用来替代ES。

目前，iPS可以从多种动物如小鼠、大鼠、猿、猕猴、猪、兔以及人类中诱导得到。然而，大多数的iPS不能得到活的嵌合体。鉴于成纤维细胞的成功，很多其他种类的细胞也被研究是否具有重编程的可能性。已经成功的细胞类型有肝细胞、胃上皮细胞、角质细胞、胃细胞、间充质细胞、神经干细胞、胰腺细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、造血祖细胞、脐带血细胞、外周血细胞等。

2 外周血诱导制备iPS的优势

由于成纤维细胞的易诱导性和较高的诱导效率，人类iPS通常是用成纤维细胞诱导的。要获得成纤维细胞首先要切下皮肤组织，再进行一段时间的细胞培养，在此过程中，患者需要承受疼痛和承担被感染的风险，从而限制了iPS的广泛应用。血细胞是用来重编程诱导最容易得到的患者组织细胞来源，因为在诱导之前，不需要培养一段时间，静脉取血比取皮肤组织安全；而且大量的外周血样本可以被冻存在血库中，直接用来得到iPS。

小鼠外周血细胞的重编程开始于2008年。Hanna等[5]利用逆转录病毒转染Oct3/4、Klf4、Sox2和 c-Myc重编程小鼠B淋巴细胞。他们通过体外表达转录因子CCAAT/结合蛋白α增强子，或敲低B细胞转录因子Pax5来提高重编程效率。Hong等[6]在p53缺失的条件下，将Oct3/4、Sox2、Klf4和 c-Myc导入小鼠T淋巴细胞获得iPS。继小鼠外周血诱导成功，Haase从人脐带血中诱导得到iPS[7]。脐带血可以直接从脐带血库中获得，且对捐赠者没有风险。Ye等[8]从健康的冻存脐带血细胞和 CD34+细胞中诱导得到iPS。但是，使用脐带血仍然有限制，因为只能从婴儿得到脐带血。

2010年，有3个研究团队分别从人的外周血细胞得到了iPS[9～11]。Loh等[10]通过静脉穿刺和聚蔗糖密度离心从外周血样品中分离得到单核细胞(PBMC)和CD34+细胞。在感染能表达KLF4、SOX2、Oct3/4和c-Myc的慢病毒后，CD34+细胞表现出0.002%的重编程效率，而PBMC细胞显示相对较低的重编程效率，为0.000 8%~0.001%。Staerk等[11]利用一个强力霉素诱导的慢病毒载体将T淋巴细胞和骨髓细胞重编程了iPS，这种慢病毒载体可编码4种重编程因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)。他们的研究结果表明，T淋巴细胞的重编程效率比骨髓细胞更高。这是因为T淋巴细胞比骨髓细胞表现出更高的增殖率并且在体外可以生长更长时间。Seki等[9]利用一种编码Oct3/4、SOX2、Klf4和c-Myc基因的SeV温度敏感突变载体将T淋巴细胞诱导成iPS，重编程效率达到0.1%。SeV载体是一个非整合型载体，不能在标准培养温度下增殖。这些特性显著增加了iPS产生的安全性。Chou等[12]利用改进的EBNA1/OriP质粒将新生儿的脐带血和成人PBMC重编程为iPS。通过这个新的重新编程载体，由外周血诱导的iPS可在14 d内得到，而先前成纤维细胞诱导得到iPS需要28～30 d。

研究发现，从外周血细胞获得的人iPS在形态学、表面抗原、多能性基因表达、DNA甲基化和分化潜能方面可以与人ES相似，PBMC来源的iPS可靠、安全。因此，从人外周血细胞获得iPS方法的成功将加快推广iPS在未来的临床应用。Lei等[13]将人iPS分化成常规的T淋巴细胞和具有抗原特异性的T淋巴细胞，用于以T细胞为基础的体外或体内免疫治疗。最近Ebihara等[14]研究表明，人iPS可以通过再分化获得大量的血细胞。因为这些细胞在体外可以无限增殖而且避免了由输血而引起的疾病传染，未来可以作为临床输血的重要来源。

3 iPS的应用

与ES相同的是小鼠iPS也可以分化成任何类型的细胞，包括生殖系细胞[15]，这意味着人们可以得到大量的各种分化细胞用于研究和治疗。Zhu等[16,17]研究了人和小鼠的iPS分化成精原干细胞和晚期雄性生殖细胞的潜能，并为揭示雄性生殖细胞发育的分子机制提供了模型。目前为止，iPS主要被应用于人类疾病模型、再生医学和药物研发三个领域。

3.1疾病模型人类遗传疾病治疗研究的主要问题是实验材料的来源，iPS可以通过建立特定的疾病模型来解决这些问题。通过利用患者特异性iPS已经建立了多种人类疾病模型，包括肌萎缩侧索硬化症、脊髓性肌肉萎缩、帕金森病、蕾特症、地中海贫血、腺苷脱氨酶缺乏症有关严重联合免疫缺陷、戈谢病、杜氏肌营养不良、贝壳肌营养不良症、亨廷顿疾病、1型糖尿病、唐氏综合征、莱施-奈恩综合征(携带者)。由iPS制作的疾病模型有助于探索疾病的发病机制，利用iPS进行特异性治疗是其整个应用领域最有价值的成果，由iPS产生各类细胞为治疗体内多种组织系统的疾病提供了可能。

3.2再生医学免疫排斥是器官移植和细胞治疗过程中存在的一个重大问题，因为长期使用免疫抑制药物治疗会产生一系列不良反应。患者特异性的iPS具有免疫标记，也就不存在免疫排斥。除此之外，通过在患者特异性的iPS中进行基因打靶可以修复由疾病引起的突变。修复的细胞可以分化成靶细胞，然后将靶细胞移植到发病区域，就可以减轻疾病症状。Hanna等[5]利用小鼠模型证明iPS可以治疗镰刀状细胞贫血病，这是一种遗传性血液疾病，使红细胞无法正常工作。通过对小鼠模型的iPS进行基因打靶可以修复由疾病引起的突变，修复的iPS可以分化成造血干细胞。这些健康的造血干细胞被移植到贫血小鼠中，然后进行增殖并产生正常的红细胞，这样就可以治疗该疾病。目前，影响以上个性化医疗实施可能性的一些限制因素仍然存在，包括iPS的安全性和重编程效率以及选择最适合重编程的细胞类型等。

3.3药物研发在药物研发的过程中，研究者会对药物的治疗效果和不良反应进行测试，使用的测试动物通常是小鼠、狗和猪。但是，这些测试费用昂贵，且人和动物存在差异。此外，动物试验也不能做到有效标准化。现在，我们可以利用疾病模型得到患者特异性iPS对新药物进行有效测试。有些治疗药物已经在多种疾病患者来源的特异性iPS中通过了测试，如脊髓性肌萎缩、家族性自主神经功能异常和LEOPARD综合征[18]。研究证实，该新型药物对患者特异性iPS能起作用，表明了它们具有良好的治疗潜力。

4iPS存在的问题

目前， iPS在临床应用上仍存在一些问题需要解决。例如在人iPS中观察到许多基因变化，包括染色体非整倍体、易位、点突变、碱基大规模重复和缺失等，这些问题可能会限制iPS在人类疾病治疗中的应用。Gore等[19]对7个实验室的22个人iPS细胞系的基因组进行外显子测序，他们在这些iPS细胞系中发现了124个亲本细胞中没有的点突变，这些突变很多涉及到蛋白质功能修复以及癌症相关基因。虽然重编程手段可能导致基因组异常，但是这并不代表所有的异常都是由它导致的，因为通过不同方法获得的人iPS都存在基因组的异常，包括更安全地使用合成mRNAs进行非嵌入式转染[20]。尽管重编程效率低是阻碍该领域研究前进的主要障碍，但是与重编效率提高相比，解决iPS中染色体异常可能更重要。因此，在未来获得较少基因组突变的iPS将是该领域的研究焦点。同样，在体细胞重编程时引起的染色体异常也急需解决。此外，还存在有关 iPS的诱导机制、最佳重编程因子、如何减少iPS基因突变的风险、如何实现定向分化、如何在临床上评估iPS的安全指数等问题。

iPS的产生被认为是生命科学的一个重大事件，并且正在迅速地走向临床应用。最新研究表明，从外周血来源的iPS及其化学重新编程策略将极大地提升其治疗潜力。随着iPS技术的改善，iPS的临床治疗未来已经可以预见。

参考文献：

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(收稿日期：2015-11-01)

中图分类号：R394.2

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)05-0099-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.042