循环肿瘤细胞在原发性肝癌诊断、预后及疗效评价中的应用进展

刘子鑫，石洁，李楠，郭卫星，程凯，孙居仙，刘善荣，程树群

(第二军医大学附属东方肝胆外科医院，上海200438)



循环肿瘤细胞在原发性肝癌诊断、预后及疗效评价中的应用进展

刘子鑫，石洁，李楠，郭卫星，程凯，孙居仙，刘善荣，程树群

(第二军医大学附属东方肝胆外科医院，上海200438)

循环肿瘤细胞(CTCs)是指自发或者因诊疗操作自肿瘤原发灶脱落，进入血液循环的肿瘤细胞，在肿瘤的侵袭、转移中起重要作用。目前临床常用的外周血CTCs的分离和检测方法主要有联合磁珠分离CD45+(CTCs检出率50%)、ISET方法(CTCs检出率50%)、密度梯度离心、EpCAM联合CD45磁珠分离法(CTCs检出率53.9%～92.9%)、体内流式细胞术(CTCs检出率60.7%)、cellsearch联合免疫荧光染色(CTCs检出率30.5%)等。CTCs“液态活检”在PLC的早期诊断中具有重要价值，且CTCs计数与PLC多灶性、门静脉癌栓的形成及患者肝功能Child-Pugh分级密切相关。外周血CTCs数与PLC患者的预后密切相关，CTCs计数越多，患者预后越差。治疗前后外周血CTCs数量变化可评价PLC的治疗效果。

循环肿瘤细胞；原发性肝癌；临床应用

原发性肝癌(PLC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，病死率居常见恶性肿瘤病死率的第3位[1]。PLC起病隐匿，发展迅速，恶性程度高，早期临床表现为肝区疼痛和恶心、食欲减退、腹胀、腹泻等消化道症状；且PLC细胞具有较强的侵袭、转移能力，病情早期即可侵犯血管、出现远处转移[2]。因此早诊断、早治疗对于PLC患者的预后具有重要意义[3]。目前临床认为的循环肿瘤细胞(CTCs)除了包括自发自肿瘤原发灶或者转移病灶脱落进入血液循环系统的肿瘤细胞外，还包括在诊疗操作中造成的肿瘤细胞脱落而进入血循环系统的肿瘤细胞[4]。由于其来源的特殊性，在肿瘤患者外周血中检测到的CTCs可能从某种程度上反应患者体内肿瘤细胞的特性，从而为临床监测肿瘤的复发转移、肿瘤的个体化治疗、判定肿瘤患者的预后提供依据[5]。本文就CTCs在PLC诊断、预后及疗效评价中的应用研究进展综述如下。

1　外周血CTCs的分离和检测方法

理想的分离检测CTCs的平台具有以下几个特征[6]：①能检测能够检测到每一个癌症患者样品血中的每个CTCs,同时在健康对照的样品中没有假阳性的出现；②高纯度,分离的CTCs不能混杂其他正常细胞；③能够保持分离得到的CTCs的活性、形态正常、蛋白核酸稳定，以便开展后续的实验研究和临床特性的获得；④廉价、高产出、快捷，以便临床推广；⑤结果稳定，可重复。到目前为止，相比于乳腺癌和结肠癌，仅有少数学者对PLC中CTCs的检测和定量方法进行了研究[7～16]。Stott等[7,8]采用流式分选后裸鼠皮下种植的方法，CTCs检出率30%；有学者[9，10]采用联合磁珠分离CD45+细胞的方法分离CTCs，CTCs检出率高达53%；Guo等[11，12]采用ISET方法分离检测了44例患者的外周血CTCs，检出率为52.3%；Xu等[13]采用密度梯度离心、EpCAM、CD45磁珠分离等方法，CTCs检出率53.9%～92.9%；Liu等[14]采用体内流式细胞术检测肝癌患者外周血CTCs的动态变化，与传统流式敏感性相比提高1.8倍；有学者[15,16]分别采用cellsaerch系统、cellsearch联合免疫荧光染色检测肝癌患者外周血CTCs，CTCs检出率分别为66.7%、30.5%。这些研究采取的研究材料均不同，有直接采用患者抽静脉血，有应用细胞系或小鼠动物模型；同时，受限于工艺差别以及各自不同的研究背景，这些报道所采用的CTC富集和检测的方法不一样，得到的结果也各有差异。

2　CTCs在PLC诊断中的应用

CTCs直接来源于肿瘤原发灶或者转移灶，其计数和分子特征的鉴定可在一定程度上反映肿瘤的特性，因此，CTCs可以作为一种新兴的肿瘤标记物来对肿瘤的诊断、转移、预后以及治疗反应进行实时检测。由于其检测对象为外周血，无需通过有创手段来对实体肿瘤进行取材就可以进行病理学检查，这种检测方式被称作是“液态活检”[17]。Yang等[12]运用流式细胞技术检测CD45-CD90+细胞在肝癌患者血液样品中的分布情况,CTC检出率高达90%，而在对照肝硬化患者、健康体检者的血液中均未检出CTC。说明CTCs“液态活检”在PLC的早期诊断中具有重要价值，当肿瘤原发灶不能被传统的检测手段检测到时，可以通过外周血检测CTCs来提前预测肿瘤的发生，为PLC的早期介入治疗提供依据，提高PLC的治疗效果。

3　CTCs在PLC预后评价中的应用

既往研究认为，肿瘤患者外周血中出现CTCs，预示着预后不良，且CTCs计数更是与肿瘤预后密切相关[18]。Liu等[14,16]研究发现，用cell-search系统检测的肝癌患者外周血CTCs数与肝预后密切相关，提示术后肿瘤复发风险高、患者生存率低。Vona等[10]研究发现外周血CTCs≥4个的肝癌患者生存期明显短于外周血未见CTCs者。Schulze等[16]也利用cell-search系统检测59例HCC患者外周血中EpCAM+细胞。他们发现CTC计数与HCC患者的总体生存期、BCLC分期、血管侵犯和肝癌特异性标记物AFP强相关。

4　CTCs在PLC疗效评价中的应用

大量研究已经证实，在肝癌切除或者肝移植前就有CTC进入循环系统，他们可能逃逸免疫系统的杀伤而在患者体内潜伏，它们以休眠的状态隐匿于患者体内，在某些因素的激发下，它们可以被激活而重新增殖，并迁移到靶器官，从而导致肝外转移或者肝内复发，这也被广泛认为是转移复发的重要一步[14,18]。并且这一现象或许增加肝癌切除或肝移植术后复发的风险，从而显著降低术后无复发生存率。为提高肝脏移植术后的无病生存期，Toso等[19]调整免疫状态，以通过免疫介导清除CTCs，达到降低CTCs的数量。当病灶不能被现有的检测手段检测到时，我们没有一个可靠的指标和靶点来指导这一阶段的治疗，这样可能错过了一个癌症治疗的关键的有效时期。而由于CTCs的特殊来源，即使是很小的病灶(<1 mm)或者在肿瘤尚未在体内形成原发灶时，我们就可以在血液中查到肿瘤细胞，因此循环肿瘤细胞可能作为一个指导此时期临床治疗的指标或者其本身可以作为治疗的靶点。有研究已经证实，治疗前后CTCs的数量上的变化可以反映肿瘤对治疗的敏感性以及增殖活性[20,21]。

CTCs作为一种肿瘤标记物出现，由于其特殊的来源，可以作为潜在的临床应用指标，近几年对其研究出现高潮[22]。同时，也由于其自身的特性使其在临床推广中也遇到困难。首先，由于肿瘤的“上皮-内皮转变”(EMT)现象，CTCs的异质性较高，从而缺少一个高度特异的生物标记[23]。其次，除了由于其高异质性和缺少特异性标记外，其数目相对较少也使得分离和检测技术更加困难。每106～107个单核细胞中才有一个CTC，这使得其分离更加困难，准确性也不容易保证[24]。

综上所述，循环肿瘤细胞(CTCs)是指自发或者因诊疗操作自肿瘤原发灶脱落，进入血液循环的肿瘤细胞，在肿瘤的侵袭、转移中起重要作用。目前临床常用的外周血CTCs的分离和检测方法主要有联合磁珠分离CD45+(CTCs检出率50%)、ISET方法(CTCs检出率50%)、密度梯度离心、EpCAM联合CD45磁珠分离法(CTCs检出率53.9%～92.9%)、体内流式细胞术(CTCs检出率60.7%)、cellsearch联合免疫荧光染色(CTCs检出率30.5%)等。CTCs“液态活检”在PLC的早期诊断中具有重要价值，且CTCs计数与PLC多灶性、门静脉癌栓的形成及患者肝功能Child-Pugh分级密切相关。外周血CTCs数与PLC患者的预后密切相关，CTCs计数越多，患者预后越差。治疗前后外周血CTCs数量变化可评价PLC的治疗效果。尽管目前CTCs的临床应用尚未普及，随材料学和组织学的发展、CTCs分离技术不断提高，CTCs在PLC诊断、预后及疗效评价中具有广阔应用前景。

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国家科技部“十二五”肝炎肝癌重大专项基金(2012ZX1000)：国家科技部“973”项目(2015CB554000)；国家癌症协同创新计划；教育部长江学者特聘教授计划(2012)；国家基金委杰出青年基金(81125018)；国家自然科学基金面上项目(81472282)；上海市卫生局新百人计划(XBR201125)；上海市科委西医引导项目(134119a0200)。

程树群(E-mail: chengshuqun@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.039

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2016-05-04)