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RNA干扰在抑制PRRSV复制上的研究进展

2016-04-06樊宏超姚睿智邓清华马德慧内蒙古民族大学动物科技学院内蒙古通辽028000

山东畜牧兽医 2016年4期
关键词:质粒靶向综合征

樊宏超 姚睿智 邓清华 马德慧(内蒙古民族大学动物科技学院 内蒙古 通辽 028000)



RNA干扰在抑制PRRSV复制上的研究进展

樊宏超 姚睿智 邓清华 马德慧*(内蒙古民族大学动物科技学院 内蒙古 通辽 028000)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起猪的一种病毒性疾病,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前还没有有效的疫苗和治疗药物,急需采取一种新的研究策略。RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术已广泛应用于抗病毒研究,本文将对近几年RNAi技术在抑制PRRSV复制上的研究进展进行综述。

PRRS是一种以导致怀孕母猪流产和仔猪呼吸困难为主要特征的疾病[1]。1990年在北美和欧洲首先发现了PRRS这种疾病[2],1996年在我国大部分地区也发现有此病的存在;2006年我国10多个省份突然爆发高热症状的PRRS,致使400多万头猪死亡[3],给我国养猪业造成了巨大的经济损失。虽然目前可应用PRRSV疫苗进行预防保护,但由于PRRSV具有高变异性,存在多个高度变异的区域,致使疫苗不能提供足够的免疫保护作用[4]。此外,目前还没有抗PRRSV的有效治疗药物,因此需要采取一种新的抗病毒策略。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由双链RNA(Double-stranded RNA,dsRNA)介导的以序列特异性诱导同源mRNA降解的转录后机制[5]。RNAi能够有效的抑制病毒的复制,一些研究表明小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)或微RNA(microRNA,miRNA)靶向作用于病毒的特异基因能很好的抑制病毒的复制,同时还展现出抗病毒活性。

1 RNAi抑制病毒复制的作用机制

研究发现RNAi广泛存在于各种生物体中,可以保护生物体基因免受外来基因的侵害,可有效地参与细胞防御与分化调控[6]。但目前针对RNAi的作用机制还没有一个确切的结论,随着研究的不断深入,认为RNAi包括起始阶段和效应阶段。RNAi的起始阶段主要发生在细胞质中,dsRNA通过外源导入、转基因或者病毒感染等方式进入目的细胞,在Dicer酶的作用下将dsRNA切割成大小为21-23nt的双链siRAN,siRNA是识别靶mRNA的标志,它的生成启动了RNAi反应[7];siRNA具有一条正义链和一条反义链,当siRNA与RNA介导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)结合时,siRNA反义链在解旋酶作用下从RISC中分离出来,通过碱基互补配对原则与同源的mRNA特异性结合,同时释放出siRNA正义链,在siRNA反义链介导下,RISC中的核酸内切酶切割与之互补的mRNA,导致mRNA发生降解,进而产生RNAi效应[8]。microRNA(miRNA)是一段长度为19~25nt的单链RNA(ssRNA),在介导RNAi过程中与siRNA有类似的功能,诱导靶mRNA的剪切或抑制mRNA的转录后翻译过程。

2 RNAi在抑制PRRSV复制方面的研究

目前,RNAi技术被认为是抑制病毒感染的有效方法之一。可以通过化学合成、体外转录、病毒载体等方法获得siRNA,通过化学合成获得miRNA,利用其来进行RNAi技术在应用方面的研究。

2.1 靶向PRRSV结构蛋白基因在RNAi过程中的研究

(1)N蛋白是PRRSV的主要结构蛋白,占病毒蛋白总量的20%~40%,在PRRSV感染细胞中起重要作用。当N基因发生变异或受到抑制,将会导致整个病毒基因组功能丧失。杨闽南[9]根据N蛋白的特点,针对N基因筛选出3个高效靶位,构建出3个短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA 是siRNA的前体分子,在体内可被核酸酶切割成siRNA)干扰质粒,在MARC-145细胞上通过病毒滴度测定,间接免疫荧光检测等技术验证了RNAi靶向N基因抑制PRRSV的复制效果,结果表明shRNA干扰质粒能很大程度的降低病毒滴度,阻止细胞病变的形成。黄良宗[10]等也针对PRRSV N蛋白基因设计、合成了3个siRNA,并构建出3个siRNA表达质粒,在细胞水平上检测了siRNA表达质粒对PRRSV复制的抑制效果,实验发现将三种siRNA表达质粒共转染细胞,能够起到很好抑制PRRSV复制的效果。(2)GP3、GP4、GP5和M蛋白都是PRRSV的结构蛋白,在病毒感染机体的过程中都起到一定的调节作用。李红梅[11]等针对GP3、GP4、GP5和M蛋白的基因构建出相应的shRNA干扰质粒,转染细胞后能有效抑制PRRSV的增殖。周芳[12]根据PRRSV M及GP5蛋白基因结构序列分别设计合成了相应的shRNA,并将其链接到载体上,构建成RNA干扰载体,在转染试剂介导下导入Marc-145细胞,同时接种PRRSV,48h后通过实时定量PCR检测得知,这两种干扰质粒均表现出抑制PRRSV增殖复制的作用。目前我们已经初步了解PRRSV结构蛋白在病毒感染机体中的作用,针对结构蛋白基因筛选合成相应的siRNA或shRNA,通过RNAi技术减少结构蛋白基因的表达,也许将为控制PRRSV感染提供一种可能性的策略。

2.2 靶向PRRSV非结构蛋白基因在RNAi过程中的研究PRRSV非结构蛋白是由ORF1a和ORF1b编码的,并不是病毒粒子的组成成分,但却在病毒的复制过程中扮演重要的角色。花婷[13]根据PRRSV 非结构蛋白12(nsp12)的基因序列设计合成引物,PCR扩增nsp12的全长基因,并将其与pEGFP-N1质粒相连接构建重组表达质粒,与针对nsp12基因合成构建的shRNA质粒,共同转染Marc-145细胞,通过Western blot发现实验组中PRRSV nsp12蛋白的表达量要明显低于对照组;同时她也验证了所构建的shRNA质粒对PRRSV的抑制效果,发现靶向nsp12设计合成的shRNA可以显著降低细胞病变和PRRSV的感染率。Xie jie xiong[14]靶向PRRSV nsp9基因合成构建了siRNA重组质粒,将其转染Marc-145细胞,接种PRRSV 24h后应用间接免疫荧光技术(IFA)、实时定量PCR等技术进行检测发现,siRNA重组质粒能够有效的抑制PRRSV nsp9基因的表达,与对照组相比可以使PRRSV nsp9基因的表达量减少86.56%~93.66%,为后续RNAi技术在抑制PRRSV复制的研究中提供了一定的基础。

2.3 miRNA抑制PRRSV复制的研究 MiRNA在病原体与宿主的相互作用中起到重要的调节作用,能通过转录后调控基因的表达,进而调控病毒的感染。为找到PRRSV基因组RNA上存在的miRNA结合位点,Li li wei[15]等通过生物信息学软件对PRRSV VJX143毒株进行了预测,结果发现仅有miR-130的结合位点位于PRRSV 5`UTR,同时发现它包含五个成员,分别是miR-130a、miR-130b、miR-1301b与miR-454,为探索miR-130与PRRSV复制之间的关系,合成了这5条miRNA模拟体,将其转染Marc-145细胞,接种PRRSV进行检测,发现转染miR-130模拟体组的病毒滴度和PRRSV ORF7基因的表达量明显低于对照组,说明miR-130在抑制PRRSV复制的过程中发挥了不可或缺的作用。张琼[16]也通过生物信息学软件筛选出宿主中可以负向调控PRRSV复制的多种miRNA,经过验证发现在细胞中过表达miR-23、miR-378和miR-505能够有效抑制PRRSV的复制。郭雪坤[17]通过应用RNA免疫共沉淀技术证明了miR-181能够靶向PRRSV的基因组RNA,将miR-181模拟体转染猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-145细胞,能显著降低病毒滴度。可见利用内源性miRNA的表达来抑制PRRSV的复制,将是控制PRRS的一种新方法。

3 展望

RNAi技术是目前进行基因功能研究的一种主要方法,已被广泛应用于基因治疗、遗传、信号传导等多个科研领域,并且有力的促进了相关科学的发展。在高速发展的今天,随着研究的不断深入,人们对RNAi机理正逐步了解和明确。PRRSV作为一种RNA病毒,可以广泛的应用RNAi技术对抑制PRRSV复制进行研究,并且已取得了重大的研究进展,筛选合成了多种能够抑制病毒复制的siRNA、shRNA和miRNA序列。相信在不远的将来,RNAi技术一定会从实验转入临床应用,充分发挥其在疾病治疗、预防等方面的作用,成功控制PRRSV感染将指日可待。

参考文献

[1]Neumann EJ,Kliebenstein JB,Johnson CD,et al.Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States[J].Am VetMed Assoc,2005,227:385-392.

[2]Collins JE,Benfield DA,Christianson WT,et al.Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs[J].Vet,Diagn,1992,4:117-126.

[3]Tian ke gong,Yu xiu ling,Zhao tie zhu,et al.Emergence of fatal PRRSV variants; unpar alleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J].PLos ONE,2007,2(6)526.

[4]Shi M,Holmes EC,Brar MS,et al.Recombination is associated with an outbreak of novel highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruses in China[J].Virol,2013,87(19),10904-10907

[5]Zamore PD,Tuschl T,Sharp PA,et al.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-deendent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals[J].Cell,2000,101:25-33.

[6]Downward J.RNA interference[J].2004,328:1245-1248.

[7]Bernstein E,Denli AM,Hannon GJ.The rest is silence [J].RNA,2001,7:1509-1521.

[8]Hammond SM,Candy AA,Hannon GJ.Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA[J].Nat Rev Gen,2001,2:110-119

[9]杨闽南.RNAi靶向PRRSV N基因GP5基因ADE表位缺失重组腺病毒免疫源性研究[D].长春:吉林大学,2014.

[10]黄良宗,钟科阳,王淑敏等.RNA干扰抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因表达及病毒复制[J].广东农业科学,2011,38(11):148-150.

[11]李红梅,贺聪,张茂.shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JXA1-R株在Marc-145细胞中复制及抗PRRSV细胞株的建立[J].中国畜牧兽医,2013,12(40).

[12]周芳.靶向基因干扰家蚕及猪若干病毒的复制和增殖研究[D].抗州:浙江大学,2012.

[13]花婷.靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP12的shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc145细胞中复制[D].南京:南京农业大学,2012.

[14]Xie jie xiong,Zhou han,Cui jin,et al.Inhibition of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by specific siRNA targeting Nsp9 gene[J].Genetics and Evolution,2014,28:64-70.

[15]Li li wei,Gao fei,Jiang yi feng,etal.Cellular miR-130b inhibits replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in vitro and in vivo[J].SCIENTIFIC REPORTS.2015.

[16]张琼.microRNAs调控猪繁殖与呼吸综合征病毒感染及致病性的机理研究[D].北京:中国农业大学,2015.

[17]郭雪坤.宿主microRNA-181抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的机制研究[D].北京:中国农业大学,2014.

中图分类号:S818.9

文献标识码:A

文章编号:1007-1733(2016)04-0050-02

基金项目:国家自然科学基金(31460662)

*通讯作者

收稿日期:(2016–01–21)

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