重组卡介苗的应用研究及进展

罗文武刘 姣朱元东刘贵军于高水（鲁抗舍里了药业有限公司 山东 济宁 272000 陕西中医药大学 陕西 咸阳）



重组卡介苗的应用研究及进展

罗文武①刘 姣②朱元东①刘贵军①于高水①
（①鲁抗舍里了药业有限公司 山东 济宁 272000 ②陕西中医药大学 陕西 咸阳）

卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin Vaccine，BCG）是牛结核分枝杆菌的突变株。上世纪二十年代卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin Vaccine，BCG）被用于接种新生儿来预防结核病。在其安全性被确定后，卡介苗被在全世界范围内推广应用，是目前官方承认的预防结核病最安全有效的疫苗［2］，是WHO推荐的，出生时预防接种的疫苗之一。到目前为止，卡介苗已经在全球近200个国家和地区对将近40亿的儿童进行了免疫接种。随着分子生物学技术水平的提高和基因工程技术的进步，人们发现BCG不仅是是一种活疫苗，还易于接受外源基因的导入表达外源蛋白，这个重要发现为BCG的应用开辟了新的机遇。随后卡介苗做为疫苗活载体被人们逐渐重视。卡介苗作为一种细胞内寄生菌，接种到机体后，既可以刺激机体产生体液免疫，也能刺激机体产生细胞免疫，是一类有广泛前景的新疫苗。

1 重组卡介苗简介

1.1 重组卡介苗的优点

rBCG是将外源基因导入BCG内，并利用BCG的活疫苗的特性，制成免疫机体后可产生针对不同抗原免疫应答的疫苗。经过近一个世纪的临床应用以来卡介苗的安全性和优点逐渐显现：（1）不受到母源抗体的干扰，免疫接种时间无限制；（2）免疫保护期长，单次免疫产生的免疫应答可达5～50年；（3）卡介苗本身是一种免疫佐剂（4）生成成本低，生产技术简单，便于保存和运输；（5）免疫方式多样可以口服静脉注射和肌肉注射；（6）是一种免疫增强剂和免疫佐剂，能够刺激机体产生持久的体液免疫和特异的细胞免疫［2］；（7）卡介苗还易于接受外源基因的导入，可以通过改变启动子纠正表达不均衡的外源基因，进而使得外源蛋白得以稳定表达。因此卡介苗也是一种非常理想的疫苗活载体［3］。

1.2 卡介苗刺激机体产生的免疫应答

机体产生的免疫应答可大体分为两种，特异性免疫和非特异性免疫。特异性免疫又有获得性免疫和自然免疫。非特异性免疫又称天然免疫。卡介苗作为一种兼性细胞内寄生菌，既能引起特异性和记忆性的获得免疫，又能刺激机体产生非特异免疫应答，这是很多外源微生物所无法比拟的。卡介苗所刺激机体产生的细胞免疫主要是由T细胞介导的。体内巨噬细胞是卡介苗的主要宿主细胞。在抵抗卡介苗感染发挥主要作用的是CD4+和CD8+T细胞。卡介苗能够被MHCII类分子进行抗原加工递呈给CD4+T细胞，进而促使其分泌在抗卡介苗感染中起到重要作用的细胞因子IFN-γ。同时也能被MHCI识别，并提呈给CD8+T细胞然后直接识别溶解杀伤靶细胞［4］。构成天然免疫的成份很多，主要包括吞噬细胞和体液杀菌成分如抗微生物肽、溶菌酶、补体等。卡介苗能引起非特异性免疫的原因其具有免疫佐剂活性。补体和抗原递呈细胞表面的受体能够识别BCG，从而使得卡介苗进入吞噬细胞内进行自我复制［5］。胞壁酰二肽是BCG细胞壁的刺激体热激蛋白（HSP）表达特殊成分。热激蛋白（HSP）含量升高可以使得机体天然免疫系统活化。MHCI类分子可以识别机体巨噬细胞摄取的HSP-肽复合物，激活CD8+T细胞的免疫应答［6，7］。BCG可以间接刺激DC细胞发育成熟，从而加强抗原递呈的能力。

2 重组卡介苗在疾病预防中的应用

2.1 细菌rBCG疫苗

肺炎球菌蛋白A（PspA）是一种细胞表面蛋白，在所有的肺炎球菌菌株表面都能稳定的表达，具有较好免疫原性。Langermann等［8］将PspA部分部分基因片段，构建多个不同的载体，转入到卡介苗内，结果发现该基因分别以包浆蛋白、分泌蛋白以及嵌合输出膜结合脂蛋白形式存在，所有的重组卡介苗均能诱导小鼠产生较高的抗体水平。血清学研究表明PspA血清有交叉免疫保护作用。Hess等［9］将李斯特菌融合核蛋白基因构建重组质粒载体，转入卡介苗中，动物实验表明，该重组卡介苗可以明显的增强MHCI对可溶性蛋白的抗原提呈作用，同时发现该融合蛋白的表达可促进诱导刺激机体产生CD8+T细胞。Baumgart等［10］构建能够表达麻风分枝杆菌18kD蛋白的重组卡介苗，实验表明，该疫苗可以刺激诱导抗体的产生以及淋巴细胞曾生应答。Ohara等［11］将麻风杆菌的Ag85A蛋白基因重组到卡介苗中来表达蛋白，免疫小鼠发现小鼠足垫中的麻风杆菌繁殖率降低，抑菌效果比亲本BCG更显著。Nasoimento 等［12］［13］将百日咳毒素S1亚基基因转入到卡介苗中，该重组卡介苗能表达S1PT蛋白。用rBCGS1PT免疫小鼠，结果发现其能刺激机体产生Th1 型免疫反应，可以保护小鼠抵抗脑内百日咳杆菌的攻击。

2.2 病毒rBCG疫苗

据报道，引起新生婴儿死亡的主要原因之一是麻疹病毒感染。Zhu等［14］将麻疹病毒核蛋白（NP）基因全长片段克隆，并导入卡介苗内构建rBCG（BCG-N），表达病毒蛋白。用麻疹病毒感染免疫接种过rBCG（BCG-N）的新生猴，结果发现，免疫该重组卡介苗不能阻止全身性的麻疹病毒感染，但是在新生猴体内仍能检测到NP蛋白的特异的淋巴细胞应答，减轻了人工感染后的肺部炎症。同时一些临床症状例如鼻咽部分泌病毒排泄物的时间显著缩短。实验结果表明，接种rBCG（BCG-N）疫苗可以刺激机体产生针对麻疹病毒的T细胞免疫应答，进而减轻了病毒对肺部的伤害。目前认为，HIV-1的主要抗原有在其他细菌系统很难表达的Gag、逆转录酶、聚合酶、Env蛋白gp 120和gp 41等。

2.3 寄生虫rBCG疫苗

2.3.1 疟原虫 疟疾是由疟原虫引起的急性、传染性寄生虫病，该病呈全球分布。Matsumoto等［15］于1998年将疟原虫（Plasmodium yoelii）的孢子蛋白（CSP）中的一段B细胞表位的基因片段和质粒载体重组后转入到BCG，该基因片段成功在BCG中表达出融合蛋白。用该重组卡介苗免疫小鼠，结果显示能刺激机体产生较高的体液免疫应答和细胞免疫，进而抵抗疟疾红内期的感染，而且免疫保护期可长达半年以上。以后的研究中发现了疟疾重组卡介苗的免疫保护机制，即rBCG能刺激机体产生IFN-γ，继而诱导机体产生在后期清除疟疾起到重要作用的免疫球蛋白抗体IgG2a。以后将编码P1yoeliiMSP-1羧基端月15000bp的基因片段重组到BCG中进行蛋白表达，免疫小鼠后也能产生免疫应答［16］。

2.3.2 利什曼原虫 目前研究表明，LCR1基因和GP63基因是利什曼原虫的重要保护性抗原。用重组LCR1蛋白免疫小鼠，可刺激机体T 细胞因子IFN-γ的分泌量上升，使得小鼠可以获得部分免疫保护。Streit 等［19］将LCR1基因的一端编码序列和pMV261穿梭载体进行重组，重组的rBCG-LCR1卡介苗能表达与预期相符的融合蛋白，免疫印迹验证该目的蛋白具有良好的免疫原性。用该重组卡介苗皮下和腹腔注射免疫接种小鼠，然后进行攻虫实验，4周后解剖小鼠发现，皮下注射组小鼠的肝脏损伤明显减轻，且能刺激小鼠产生Th1免疫应答，但是腹腔注射免疫组未能产生理想的保护效果。

2.3.3 血吸虫 Kremer等［20］构建一种曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）的重组卡介苗，这种疫苗是将谷胱甘肽转移酶（Sm28GST）基因片段克隆转进BCG中，结果这种重组卡介苗可以表达出具有酶活性的Sm28GST蛋白。这种重组蛋白可以被谷胱甘肽特异的识别。随后将这株重组卡介苗免疫小鼠后，结果可以在小鼠体内检测到IgG1、IgG2a、IgG2b抗体亚型和中和抗体反应。这些抗体的产生对血吸虫的感染的保护性良好。通过静脉注射、腹腔注射、皮下注射和鼻内等免疫方式将重组卡介苗免疫小鼠，均能刺激机体产生体液免疫反应。并且免疫效果随免疫次数的增加而增强。后来又将重组卡介苗构建成表达Sh28GST的重组体，并且发现该蛋白具有酶活性，免疫小鼠表现较强的免疫应答［21］。

2.3.4 肝片吸虫 肝片吸虫是一种寄生在动物机体肝脏胆管内能引起急性或慢性肝炎的寄生虫。肝片吸虫病呈世界性分布，对机体危害较大。目前研究表明FH3基因是肝片吸虫主要的保护性抗原基因之一。周宇［22］在2003年筛选到肝片吸虫的FH3抗原基因，并对其进行研究，首先构建pMV261-FH3重组穿梭质粒，然后用电转化的方式构建重组卡介苗，经过热激诱导后检测能表达与预期相符的相对分子质量约为22000的融合蛋白。为今后的肝片吸虫重组卡介苗的研究提供重要的理论依据。

2.3.5 鸡球虫 王秋悦［23］将筛选到的柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）膜内丝氨酸蛋白酶Rhomboid基因重组到梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中，构建了重组质粒，用电转化的方法将其导入卡介苗中，然后热激诱导蛋白表达，发现成功表达了具有抗原活性的Rhomboid。后期实验中，将两种重组卡介苗经多种方式免疫雏鸡后用一定数量E.tenella卵囊进行感染，结果发现重组卡介苗有一定的免疫保护作用，抗球虫指数高达174.6。同时，她用荧光蛋白（EGFP）对重组卡介苗pMV361-Rho株进行标记，免疫雏鸡一周后，结果发现Rhomboid基因在鸡体内各组织器官均有表达，表达量大约在免疫后14d达到最多，随后逐渐下降，28d以后基本消失。在后续实验中，为了增强免疫效果，将鸡的白介素2基因和Rhomboid基因串联，并构建了联合基因重组卡介苗，动物实验表明，以滴鼻的免疫的pMV261-Rho-IL-2重组卡介苗效果最好，抗球虫指数超过180。

2.3.6 弓形虫 王洪法［24］［25］首先将弓形虫ROP2 基因在大肠杆菌中进行原核表达及免疫原性分析，发现该基因有较好的免疫原性。然后将ROP2基因和卡介苗穿梭表达载体pMV262以及整合表达载体 pOIP23H进行重组，电转化到卡介苗中，结果发现可诱导蛋白表达。经静脉注射和口服两种方式将重组卡介苗免疫小鼠，检测结果发现免疫组血清细胞因子IFN-γ、IL-2及CD4+、CD8+T 细胞与对照组比较差异显著。静脉注射免疫pMV262-ROP2重组卡介苗组小鼠的存活时间显著延长。

3 重组卡介苗的前景

走过80多年历程的卡介苗是唯一用于预防结核病的疫苗。在预防人类结核病的中发挥着非常重要的作用。近十几年以来国内外研究者已经证实，BCG作为活载体表达系统以成功诱导包括病毒、细菌、寄生虫抗原基因以及细胞因子在内的多种蛋白。如今，rBCG的研制引起了广泛的关注，人们希望对rBCG的载体和选择系统的稳定方面进行改进，进而使其在预防更多疾病方面发挥更出色的表现。但是目前，针对重组卡介苗需要解决的问题还很多。首先外源基因的导入能否改变其弱毒疫苗的性质［26］。其二，BCG表达的蛋白缺少真核生物所具有的翻译后的加工修饰以及糖基化、装配等问题。再者，如何保证同时将多种外源基因导入BCG时，各基因能协同高效的表达。相信伴随着基因工程手段的不断提高和分子生物学的发展，加上研究者们坚持不懈的努力，rBCG疫苗在疾病的治疗和预防方面有更出色的表现。

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中图分类号：S852.4

文献标识码：A

文章编号：1007-1733（2016）04-0047-03

收稿日期：（2016–01–12）