新型兽用疫苗佐剂研究进展

杨 飞　（山东省枣庄市峄城区畜牧兽医局　277300）

新型兽用疫苗佐剂研究进展

杨 飞（山东省枣庄市峄城区畜牧兽医局277300）

相比于传统的灭活或活体疫苗，由基因工程重组抗原或化学合成多肽组成的现代疫苗往往存在免疫原性弱等问题，需要免疫佐剂来增强其作用。疫苗佐剂能够提高机体对抗原的适应性免疫应答，在疫苗的研发中具有重要的作用。随着药物研发的不断进步，近年来国内外出现了许多新型佐剂。尽管传统的铝盐佐剂是目前唯一全球公认的人用佐剂，但存在激发细胞免疫应答能力差等不足，因此，需要研发更为安全有效的兽用新型佐剂，尤其是安全无毒、能够刺激较强细胞免疫应答的佐剂，以及适合粘膜疫苗，亚单位疫苗及DNA疫苗等的免疫佐剂。本文分类阐述了近年来疫苗佐剂的最新研究进展及应用概况，总结了佐剂对免疫系统的影响和作用机制，临床有效性和不良反应，以及新型佐剂研发最新关注热点。

疫苗佐剂是能够提高机体对抗原的适应性免疫应答的物质[14]，能够在免疫反应低下的动物中诱导全面持久的免疫应答，因此疫苗佐剂在疫苗的研发中具有重要的作用。传统兽用疫苗中常用的佐剂有铝盐佐剂和油佐剂。铝盐佐剂为目前应用最广泛的一类佐剂，但其在诱导细胞毒性T细胞及Th1型反应中作用很有限，在同高纯度的小分子蛋白抗原共同使用时不能引起足够的抗体应答[1]。油佐剂疫苗在促进疫苗效果方面优于铝盐佐剂疫苗，但由于油佐剂皮下注射会引起炎症、溃疡和肉芽肿，且不易代谢。因此，研制和开发新型佐剂，已成为新疫苗研究中的一个重要领域[2-4]。目前，随着基因工程亚单位疫苗及DNA疫苗的研究，高度纯化新型疫苗的生产技术得到不断突破，但其抗原常常不能诱导较强的免疫应答[2]。因此要使新型疫苗的缺点得到弥补，最常用的方法是以适当的佐剂与之配合使用。而常规的佐剂由于其自身的缺陷使之很难适应新型疫苗的发展，因此新型佐剂的研究工作已经逐渐引起科研工作者的注意。

1　纳米粒子佐剂

（1）纳米粒子一般是指粒径在1～100nm范围内的超微粒子，纳米技术是指在1～100nm的量度范围内研究原子、分子的结构及相互作用并加以应用的技术，物质用纳米技术细化之后，具有比表面积大，表面活性中心多，反应活性高，吸附和催化能力强的特点，因此会产生体积效应，表面效应，量子尺寸效应，目前关于纳米材料用作疫苗佐剂，已受到极大重视，纳米粒子能穿透组织间隙，也可通过机体最小的毛细血管，且分布面极广，易被消化和吸收，而且包裹或表面结合抗原的纳米粒子能使蛋白抗原的表面充分暴露，同时使抗原结构更稳定，在体内能引起强烈的特异性免疫反应。（2）大量的实验都表明，纳米粒子佐剂可有效提高细胞免疫，体液免疫和黏膜免疫，美国密歇根州大学生物纳米科技中心，将小鼠免疫流感病毒A和纳米乳剂的混合物免疫小鼠，20d后用致死剂量的流感病毒感染小鼠，结果免疫动物受到了完全的保护，而接种了甲醛灭活病毒或纳米乳剂的小鼠，则发展为病毒性肺炎，6d后死亡[15]。Stieneker等发现聚甲基丙烯酸甲酯纳米粒子对大鼠体内的AIDS疫苗起辅助作用时，与氢氧化铝辅助作用相比，抗体的滴度要高出100～1000 倍[16]。柴家前等通过专门技术制备纳米蜂胶颗粒(NPP)，发现NPP使雏鸡血液中的T淋巴细胞比率和RBC2C3bR花环率都极显著增加，而RBC21C花环率显著降低[5]。纳米佐剂是目前研究的热点，可避免传统疫苗的载体效应发生，还可提高生物利用率，提高制剂的均匀性，分散性和吸收性，具有较理想的免疫增强作用。

2　天然来源的佐剂

2.1蜂胶蜂胶是蜜蜂从植物中采集的树脂、花粉及蜂蜡等混合物，内含几十种生物活性物质、多种维生素、氨基酸、脂肪酸、多糖及酶等，具有广谱抗病毒、抗细菌和抗霉菌作用。其具有增进机体免疫功能和促进组织再生的作用，应用蜂胶或配合抗原能增强免疫功能以及补体和吞噬细胞活力，增加白细胞的产生和抗体产量，并使特异性凝集素的产生大大增加。赵恒章等以油乳剂、蜂胶和铝胶为佐剂，按一定比例配制成巴氏杆菌的灭活苗[6]。经试验证明，该疫苗安全，有效，其中铝胶苗的效果不及蜂胶苗和油苗，油苗的保护期和蜂胶灭活苗的保护期相当，但蜂胶灭活苗的抗体水平上升速度比油苗快且保护率高。欧阳素贞在大肠杆菌病多价蜂胶苗对肉仔鸡免疫效果的跟踪研究中证明，该蜂胶疫苗对禽大肠杆菌病的免疫效果可靠[7]；另外发现淫羊霍-蜂胶佐剂不仅能提高小鼠外周血T淋巴细胞的转化率，而且影响抗环磷酸胺对T淋巴细胞的抑制作用，使受抑制的T淋巴细胞转化活性基本恢复正常，并能刺激T，B淋巴细胞活化，显著提高CTL活性[8]。

2.2多糖，糖苷及复方中药多糖是一类具有广泛生物活性的生物大分子物质。植物多糖来源于植物的根、茎、叶、皮、种子和花，由相同或不同单糖以 α或β-糖苷键所组成，分子量数万甚至数百万。其具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗感染、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、降血糖、降血脂等功用，对机体毒副作用小。中药多糖特别是补益类中药多糖一般都有增强机体免疫功能的作用，而对正常细胞没有毒副作用，是良好的生物反应调节剂，很有希望开发成为新型疫苗佐剂，从中草药植物中提取糖苷，与病毒及类脂混合，在一定条件下形成一种性能稳定的复合制剂，免疫增强作用明显，此外，一些复方中药也可作为佐剂，如紫术散，当归补血汤等，对免疫激活和提高免疫都有很大的作用。总之，中药佐剂安全，有效，可靠，稳定，是一个很有发展前景的佐剂，但因其产地不同，采收时间差异，有效成分的含量不如西药那样容易确定，另外一些佐剂制作烦琐，价格高，效果不稳定，限制了它的推广使用，目前将中药作为疫苗佐剂研究存在很多问题，如分子结构不明确，质量标准不易控制，生物活性的影响因素多等。柳钟勋从当归中提取的当归多糖(ASDP)和当归内酯(ASDE3)作为乙肝疫苗基因工程疫苗佐剂，发现ASDP/ASDE3的免疫效果明显优于铝佐剂，且有效剂量范围广，毒性小[9]。另外，枸杞多糖作为甲肝疫苗的佐剂效果与铝佐剂相似，且与铝佐剂有协同作用。谢勇等研究发现以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌蛋白抗原对幽门螺杆菌感染具有免疫保护作用，可明显促进TH2细胞因子的分泌，且与CT有协同作用[10]。林树乾等发现黄芪多糖与金黄色葡萄球菌灭活苗联用后可以显著提高血清抗体滴度且抗体维持一个较高水平[11]。

3　脂质体

脂质体是单层磷脂或由数层可溶性物质隔开的呈同心圆状排列的连续多层磷脂所组成的脂质小囊，既是抗原载体，也是免疫佐剂。其具有多种优点：安全性高，天然靶向型，能降低被包裹抗原的毒性，增强动物对抗原物质的耐受性，提高抗原稳定性，延长疫苗使用期，降低贮存条件。但又存在由于所用材料的尾部脂肪酸有不同程度的双链，导致贮存时会随时间而逐渐氧化，产生溶血磷脂；小脂质体倾向于相互融合成大脂质体，在融合过程中可导致包入的抗原释放等缺点。70年代Edgar等系统研究了LPS的性质并用沙门氏菌的LPS水解得到MPLA，发现MPLA对患肿瘤的几内亚猪有保护作用，而其毒性只占LPS的0.08%。近年来，人们做了很多工作来验证Edgar的工作。IL-1b是一种促炎症因子，在小鼠的研究[17]中，MPLA强烈刺激IL-1b的mRNA翻译，相似的模式在后来研究中再次发现[18]，小鼠脾脏在注射MPLA后强烈表达IL-1b，但血清中IL-1b含量相比注射LPS组小鼠要低很多。由此可知MPLA与LPS同样具有刺激促炎症因子IL-1b的作用，但MPLA作用下IL-1b只被限制在特定部位起作用。刘湘涛等报道，用脂质体、油乳剂、明矾及金黄色葡萄球菌免疫复合物为佐剂，分别与禽多杀性巴氏杆菌的主要保护性抗原荚膜多糖(CPS)配制成疫苗免疫鸡，结果显示，脂质体组的IgG抗体水平高，抗体持续时间最长[12]。脂质体还是一种有效的黏膜免疫佐剂，能诱导分泌型IgA(SigA) 的产生。Alezn 等认为，脂质体疫苗经下呼吸道免疫雌性小鼠，除诱导全身IgG和呼吸道SIgA分泌外，还可诱导阴道分泌物中产生特异性IgA，即远端黏膜区产生SigA。

4　细胞因子

细胞因子可调节细胞增殖分化并诱导细胞发挥功能的高活性多功能多肽蛋白或糖蛋白。其具有明显的免疫佐剂效应，可增强病毒、细菌和寄生虫疫苗的保护效应，激发对肿瘤抗原的免疫反应。先前研究得出细胞因子通过免疫调节提高抗原提呈能力，诱导并增强CTL的作用；细胞因子佐剂能使机体持续产生抗体，并阻碍淋巴滤泡中生发中心的形成；细胞因子能将B细胞与外周隔绝，使抗体生成下降，从而起到阴性免疫调节作用。

4.1粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)GM-CSF能募集并活化APC，增强初级免疫应答。但GM-CSF的实际应用受限于其毒性，需要多次注射和异源免疫[19]。在有关人用疫苗佐剂研究中上市产品主要用于癌症化疗引起的骨髓移植。可作为疫苗和单抗的复合佐剂，在上市适应症范围内有较好的耐受性[20]。

4.2白介素-12(IL-12)IL-12是目前发现的主要由B细胞产生的细胞因子，与IL-2有协同作用。除此之外，IL-12可提高黏膜和体液免疫应答中IgG2α和IgA的水平，明显降低细菌的侵入量[13]。研究证明，其可激活Th1细胞，有望用于临床试验的细胞因子佐剂。它加强Th1型细胞免疫，目前正在进行AIDS和肿瘤治疗的临床试验[21]。

4.3白介素1(IL-1)IL-1是由抗原-抗体复合物、炎性细胞因子IL-1家族与OVA和破伤风毒素的联合免疫，提高血清和黏膜中IgG和IgA的水平，增强细胞免疫应答[13]。近年来，IL-1介导固有炎性反应，其佐剂性质引起了研究者们越来越多的关注。细胞因子可以与DNA疫苗中的抗原共表达，提高DNA疫苗的效应[20]。但是由于表达和纯化的成本高，免疫时需多次注射，因而未得到广泛应用。

5　展望

以上所述的佐剂种类繁多，效果明显，但它们也有一些不可避免的缺点，合理选择和使用佐剂不但可以节约抗原的使用量，还可以迅速刺激免疫系统，增强免疫应答，特别对免疫力低下的动物意义重大。为了追求可以以最小的免疫刺激即可引起适当的免疫促进作用，粘度较低、颗粒大小均匀、稳定性良好，在机体内存在时间较长，并可提高血中抗体浓度，局部反应轻微，且无不良反应等的理想免疫佐剂，已逐步成为研究的热点。以多糖类物质佐剂为例，一些多糖分别或同时具有调节淋巴细胞、吞噬细胞、白细胞介素、抗体水平以增强免疫功能；一些多糖可经化学修饰形成多孔微颗粒，具有浓缩和储存抗原的作用。多糖微粒可耐受胃肠道的降解，可发展成口服免疫载体。可见，随着分子免疫学等基础理论的快速发展，免疫佐剂的作用不再局限于增强免疫应答，而更着重于其诱导机体选择性地产生有效防御相应病原体感染的特异性的免疫应答并减少抗原物质的副作用。目前对免疫佐剂研究的主要趋势是多来源、多途径开发出低廉、高效、速效、长效的新型佐剂并探索其作用机理。随着佐剂大量出现的同时，随之而来的是对其安全性的担忧。因此，未来的工作重点之一应是深入研究佐剂的作用机制，全面推测其对免疫系统的影响，寻找并建立合理可靠的动物模型，预测免疫毒性发生的可能性。

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（2016–08–22）