护卵颗粒对重复制动应激致卵巢功能减退模型大鼠的影响

黄雪君孙冬梅陈玉兴甘海宁黄 琳赵静宇（广东省中医药工程技术研究院，广东省中医药研究开发重点实验室，广州，50095；广州中医药大学，广州，50006）



护卵颗粒对重复制动应激致卵巢功能减退模型大鼠的影响

黄雪君1孙冬梅1陈玉兴1甘海宁1黄 琳2赵静宇2
（1广东省中医药工程技术研究院，广东省中医药研究开发重点实验室，广州，510095；2广州中医药大学，广州，510006）

摘要目的：观察护卵颗粒对重复制动应激致大鼠卵巢功能减退的治疗作用。方法：模型组采用性周期规律的雌性SD大鼠置于特制的束缚制动筒内，固定身体使之不能随意活动，制动应激1次／d，连续15 d建立卵巢早衰大鼠模型，每天阴道图片观察大鼠动情周期变化，造模成功后分为6组：模型对照组、补佳乐组、调经促孕丸组及护卵颗粒高、中、低剂量组，另取10只作为空白对照组，连续给药4周。给药结束后经开野行为测定后腹主动脉采血，冰台上取大鼠下丘脑，留取卵巢组织标本。测定血清雌二醇（Estradiol in serum，E2）、促卵泡激素（Follicle-stimulating Hormone，FSH）、黄体生成素（Luteinizing Hormone LH）、孕酮（Progesterone，PROG）水平及检测下丘脑多巴胺（Dopamine，DA）、去甲肾上腺素（Noradrenaline，NA）、五羟色胺（Hydroxytryptamine，5-HT）含量，观察卵巢湿重变化及组织学改变。结果：护卵颗粒各剂量组能明显提高重复制动应激致卵巢早衰大鼠的水平和垂直活动得分，能提高卵巢早衰大鼠血清E2、PROG水平和降低FSH、LH水平，降低卵巢早衰大鼠下丘脑DA、NA及5-HT含量，与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0. 05或P＜0. 01）。与模型组比较，护卵颗粒高、中剂量组大鼠卵巢内各级卵泡数增多，卵巢指数增加。结论：护卵颗粒可以提高卵巢功能减退模型大鼠水平活动和垂直活动，增加E2、PROG及NA的分泌，增加卵巢指数，促进卵巢功能减退大鼠的卵泡生长，恢复受损卵巢的内分泌功能。

关键词护卵颗粒；卵巢功能减退；重复制动应激；开野行为

Effect of HuLuanKeLi on Diminished Ovarian Reserve Rats with Repeated Immobilization Stress

Huang Xuejun1，Sun Dongmei1，Chen Yuxing1，Gan Haining1，Huang Lin2，Zhao Jingyu2
（1 Guangdong Research Institute of Traditional Chinese Medicine（TCM）Manufacturing Technology，Guangdong Province Key Laboratory of TCM Research and Development，Guangzhou 510095，China；2 Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

Abstract Objective：To observe the effects of HuLuanKeLi on diminished ovarian reserve in rats of repeated immobilization. Methods：The adult female rats with regular cycle in model group were exposed to the scheduled daily repeated immobilization for 15 days，one time per day. The duration of immobilization was progressively increased with the subsequent episode. Daily vaginal smears were permfored to follow the estrous cycle in rats. After molding，60 rats were subdivided into 6 groups（n ＝10）：Model group，BuJiaLe group，TiaoJingCuYunWan group，high-dose、middle-dose and low-dose group，treated for 4 weeks respectively. After Openfield testing，blood samples were obtained from abdominalaorta，and samples of ovarian tissues were harvested. Serum levels of Estradiol（E2），Follicle-stmiulating hormone（FSH），Luteinizing hormone（LH），Progesterone（PROG）and hypothalamus content of Dopamine（DA），Norepinephrine（NA），Serotonin（5-HT）were measured by ELISA，and the changes of wet weight and histology of ovary were observed. Results：Compared with the model group，HuLuanKeLi increased serum level of E2，PROG and decreased FSH，LH；and decreased hypothalamus content of DA，NA，5-HT（P＜0. 05or P＜0. 01）；and the wet weight of ovary increased in each dose of HuLuanKeLi groups. Conclusion：HuLuanKeLi can promote follicle growth in rats with premature ovarian failure，increase secretion of ovarian E2，PROG，and improve endocrine function of damaged ovaries.

Key Words HuLuanKeLi；premature ovarian failure；repeated immobilization；openfield

卵巢产生卵子能力减弱，卵泡质量下降，导致女性生育能力下降及性激素的缺乏，称卵巢功能减退即卵巢储备功能下降（Diminished Ovarian Reserve， DOR）。DOR临床表现可无症状，或仅表现为生育力的下降，或轻微的月经改变等，若患者诊断不及时而延误治疗，容易发展为卵巢早衰（Premature Ovari-an Failure，POF），而增加了治疗的难度。中医的“肝”是机体调节心理应激反应的核心，在心理应激的状态下，最先受到影响的是人体的气机，中医肝主疏泄与心理应激状态下导致的神经内分泌紊乱、免疫功能异常等密切相关。肝气郁结证是主要中医证型之一，中医药治疗已经取得较好的疗效，而且副作用小［1-3］。

护卵颗粒（加减益经颗粒）是由加减益经汤经现代工艺制成的中成药制剂。护卵颗粒是根据《傅青主女科》的学术思想，在益经汤的基础上加减而成，应用于DOR患者，取得了较好的疗效。它由熟地黄、菟丝子、当归、丹参、党参、柴胡、白芍等中药组成，方中以熟地黄、菟丝子、杜仲补肾之阴阳，柴胡调达肝气以实肝用，当归白芍补血养肝以养肝阴，全方补肾疏肝兼以活血健脾。本实验通过建立重复制动应激致肝郁型卵巢功能减退大鼠模型，观察护卵颗粒对卵巢功能减退大鼠的治疗作用，为临床治疗提供实验依据。

1　资料与方法

1. 1 一般资料

1. 1. 1 药物 护卵颗粒（加减益经颗粒），由广东省中医研究所制剂实验室提供，批号为131003。戊酸雌二醇片（补佳乐），法国DELPHARM Lille S. A. S公司产品，批号251A2。调经促孕丸，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号2035224。

1. 1. 2 动物 SPF级雌性SD大鼠，体重180～220 g，由广东省医学实验动物中心提供，实验生产合格证号和动物合格证号分别为SCXK（粤）2008-0002 和NO 44007200010888。实验设施使用许可证号：SYXK（粤）2010-0059。

1. 1. 3 试剂 ELISA Kit for Rat E2，Batch No. 1406251；ELISA Kit for Rat FSH，Batch No. 1406251；ELISA Kit for Rat LH，Batch No. 1407252；ELISA Kit for Rat PROG，Batch No. 1407261；ELISA Kit for Rat Dopamine，Batch No. 1407181；ELISA Kit for Rat NA，Batch No. 1407101；ELISA Kit for Rat Serotonin，Batch No. 1407271；以上均为上海西唐生物科技有限公司产品。

1. 1. 4 仪器 JJ3000动物电子称，G＆G公司产品；BS224S万分之一电子天平，德国SARTORIUS产品；Bio-RAD 680酶标仪，美国伯乐公司产品；YD-AB型摊烘烤片机，YD62型石蜡包埋机，YD-6L型智能冰冻包埋机，浙江金华益迪产品；Leica RM2235轮式切片机，Leica TP 1020型全自动脱水机，德国莱卡公司产品；Shandon Gemini染色机，德国Thermo公司产品；DHG-9203型电热恒温干燥鼓风干燥箱，上海精密实验设备厂产品；Olympus DP2-BSW型病理图像采集系统，日本奥林巴斯公司产品。

1. 2 方法

1. 2. 1 剂量设置 剂量换算方法参考《中药药理研究方法学》“体表面积比”换算动物等效剂量［4］。护卵颗粒：临床日用量65. 50 g生药，大鼠等效剂量为5. 895 g生药／kg，设为中剂量。高、中、低剂量组分别对应护卵颗粒11. 790 g生药／kg、5. 895 g生药／kg、2. 9475 g生药／kg。戊酸雌二醇片：临床日用量1 mg，大鼠等效剂量为0. 09 mg／kg。调经促孕丸：临床日用量10 g，大鼠等效剂量为0. 9 g／kg。

1. 2. 2 造模方法 SD大鼠适应性喂养1周后，行阴道脱落细胞涂片检查，1次／d，连续10 d，筛选出动情期为4～5 d，并连续出现2个动情周期的大鼠。将有规律性周期的雌性大鼠取10只作为空白组，其余大鼠为模型组，按照文献方法［5-6］，应激时间安排在9：00 AM～5：00 PM之间，大鼠置于特制的束缚制动筒内，固定身体与尾部，使之不能随意活动，制动应激1次／d，连续15 d，第1～3天每天制动应激2 h，以后每3 d延长应激时间1 h。

1. 2. 3 分组及给药 应激结束后大鼠取血测定血清E2含量，以低于180 pg／mL为造模成功，除空白组10只大鼠外，取造模成功大鼠60只随机分为6组，分别为模型组、补佳乐组、调经促孕丸组及护卵颗粒高、中、低剂量组，每组10只。护卵颗粒各剂量组及补佳乐、调经促孕丸组大鼠按剂量灌胃给药，10 mL／kg，1次／d，连续4周，空白组、模型组大鼠给予等体积蒸馏水。

1. 2. 4 检测指标 1）阴道脱落细胞检查［7］：开始造模后，每天进行大鼠阴道细胞学涂片苏木素伊红染色后镜检观察其动情周期变化。2）开野行为测定（Open-field）［8］：在方形木箱（80 cm×80 cm×40 cm）进行，周壁为黑色，底面分为均匀的方格。实验时在安静的房间将大鼠放在木箱正中，以大鼠三爪以上跨入邻格的次数为水平活动得分，两前肢离地或攀附墙壁1 cm以上的次数为垂直活动得分。每只大鼠每次测定时间为5 min，彻底清洁木箱后观察下一大鼠。3）血清指标检测：大鼠腹主动脉取血，分离血清，血清置于-20℃保存待测。以酶联免疫法测定大鼠血清中E2、FSH、LH、PROG水平的变化。4）神经递质的检测：断头处死大鼠，冰台上打开颅腔，取下丘脑，液氮速冻后入低温冰箱保存。生理盐水研磨10%匀浆，酶联免疫法检测下丘脑DA、NA、5-HT含量。5）卵巢称重：完整取出大鼠卵巢及子宫，去掉筋膜及脂肪组织，电子天平称重，将称得的卵巢湿重、子宫湿重分别除以体重，按以下公式计算：卵巢指数＝卵巢湿重（mg）／体重（g）×100%，子宫指数＝子宫湿重（mg）／体重（g）×100%。6）卵巢组织形态学观察：称重后置福尔马林固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，行组织形态学观察。

1. 2. 5 统计学方法 所有计量资料以均数加减标准差（±s）表示。多组间均数的比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间均数两两比较，方差齐时采用SNK法；方差不齐时采用Dunnett's T3法。由SPSS 15. 0软件完成。

2　结果

2. 1 对大鼠动情周期的影响 通过阴道涂片观察所得，各大鼠造模前动情周期变化规律，周期约4～5 d。除空白对照组外其余各组大鼠自身免疫造模后大鼠出现动情周期改变，停止于动情间期；空白对照组仍有规律的动情周期。模型对照组造模后4周内动情周期紊乱；补佳乐组、护卵颗粒高、中剂量组给药后14～15 d出现完整的动情周期；低剂量组给药后19～20 d左右开始出现动情前期，持续8～10 d，至给药4周结束前出现动情期；调经促孕丸组给药后15～17 d出现动情周期，周期时间延长。

2. 2 对重复制动应激大鼠开野行为的影响 由表1可见，各组大鼠Open-Field法测定水平活动，与空白对照组相比，模型对照组的大鼠水平活动得分显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0. 01），护卵颗粒高、中、低剂量组与补佳乐组、调经促孕丸组大鼠水平活动得分明显高于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0. 05或P＜0. 01）。

各组大鼠Open-Field法测定垂直活动，与空白对照组相比，模型对照组的大鼠水平活动得分显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0. 01），护卵颗粒高剂量组与调经促孕丸组大鼠垂直活动得分明显高于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0. 05或P ＜0. 01）。

2. 3 对大鼠血清E2、FSH、LH、PROG的影响 由表2可知，给药4周后，模型对照组大鼠E2及PROG与空白对照组比较明显降低，护卵颗粒各剂量组与补佳乐组、调经促孕丸组大鼠E2及PROG与模型对照组比较显著增加，差异有统计学意义（P＜0. 05或P ＜0. 01）。模型对照组大鼠FSH、LH与空白对照组比较明显增高，护卵颗粒各剂量组与补佳乐组、调经促孕丸组大鼠FSH与模型对照组比较显著降低，差异有统计学意义（P＜0. 01），护卵颗粒各剂量组大鼠LH与模型对照组比较显著降低，差异有统计学意义（P＜0. 05）。

2. 4 对大鼠垂体DA、NA、5-HT的影响 由表3可知，给药4周后，模型对照组大鼠DA、NA、5-HT与空白对照组比较明显增高，护卵颗粒高剂量组与补佳乐组大鼠DA与模型对照组比较显著降低，差异有统计学意义（P＜0. 01），护卵颗粒高、中剂量组与补佳乐组、调经促孕丸组大鼠NA与模型对照组比较显著降低，差异有统计学意义（P＜0. 01或P＜0. 05），护卵颗粒各剂量组与补佳乐组、调经促孕丸组大鼠5-HT与模型对照组比较显著降低，差异有统计学意义（P＜0. 01或P＜0. 05）。

2. 5 对大鼠卵巢指数、子宫指数的影响 由表4可知，大鼠给药4周后，模型对照组大鼠卵巢指数与空白对照组比较明显下降，差异有统计学意义（P＜0. 01）。护卵颗粒各剂量组与补佳乐组、调经促孕丸组大鼠卵巢指数与模型组比较显著增加，差异有统计学意义（P＜0. 05）。各给药组与空白对照组及模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0. 05）。

表1　护卵颗粒对重复制动应激大鼠水平活动、垂直活动的影响（±s，n＝10）

表1　护卵颗粒对重复制动应激大鼠水平活动、垂直活动的影响（±s，n＝10）

注：与空白对照组比较，*P＜0. 05，**P＜0. 01；与模型对照组比较，＃P＜0. 05，＃＃P＜0. 01。

组别　　剂量　　水平活动得分　　垂直活动得分空白对照组-69. 60±6. 69　32. 20±10. 23模型对照组　-　32. 00±7. 60**　13. 40±5. 50**补佳乐组　0. 09 mg／kg　41. 00±8. 41**＃　17. 60±4. 72**调经促孕丸组　0. 9 g／kg　53. 40±10. 97**＃＃　22. 60±8. 17*＃护卵颗粒高剂量组　11. 79 g／kg生药　63. 70±11. 03＃＃　29. 60±5. 10＃＃护卵颗粒中剂量组　5. 895g／kg生药　60. 30±13. 38＃＃　25. 10±9. 31＃＃护卵颗粒低剂量组　2. 9475 g／kg生药　47. 80±10. 70**＃＃　21. 80±6. 48*＃

表2　护卵颗粒对卵巢功能减退模型大鼠E2、FSH、LH、PROG的影响（±s，n＝10）

表2　护卵颗粒对卵巢功能减退模型大鼠E2、FSH、LH、PROG的影响（±s，n＝10）

注：与空白对照组比较，*P＜0. 05，**P＜0. 01；与模型对照组比较，＃P＜0. 05，＃＃P＜0. 01。

组别　　剂量　E2（pg／mL）　FSH（ng／mL）　LH（ng空白对照组　-　273. 01±60. 72　1. 06±0. 52　1. 45±0模型对照组　-　116. 27±58. 82**　3. 76±0. 75**　4. 38±1补佳乐组　0. 09 mg／kg　210. 24±49. 68＃　2. 26±0. 58**＃＃　2. 46±0调经促孕丸组　0. 9 g／kg　181. 68±53. 30*＃　2. 82±0. 58**＃＃　2. 04±1护卵颗粒高剂量组　11. 79 g生药／kg　 239. 25±91. 27＃＃　2. 35±0. 55**＃＃　1. 66±1护卵颗粒中剂量组　5. 895 g生药／kg　 211. 68±73. 47＃　2. 39±0. 33**＃＃　1. 44±0护卵颗粒低剂量组　2. 9475 g生药／kg　 198. 12±52. 64＃　2. 77±0. 41**＃＃　1. 60±0 ／mL）　PROG（ng／mL）. 60　424. 71±47. 85 . 92*　286. 19±79. 72**. 99　363. 76±69. 72＃. 06　377. 85±63. 50＃. 04＃　384. 69±75. 66＃. 53＃　367. 84±48. 56＃. 76＃　356. 80±83. 75＃

表3　护卵颗粒对卵巢功能减退模型大鼠DA、NA、5-HT的影响（±s，n＝10）

表3　护卵颗粒对卵巢功能减退模型大鼠DA、NA、5-HT的影响（±s，n＝10）

注：与空白对照组比较，*P＜0. 05，**P＜0. 01；与模型对照组比较，＃P＜0. 05，＃＃P＜0. 01。

组别　　剂量　DA（pg／mL）　NA（ng／mL）　5-HT（ng／mL）空白对照组-42. 42±10. 93　4. 88±1. 35　25. 94±3. 55模型对照组　-　87. 47±19. 69**　13. 66±3. 43**　50. 77±7. 69**补佳乐组　0. 09 mg／kg　45. 21±6. 88＃＃　5. 46±1. 64＃＃　34. 48±2. 34**＃＃调经促孕丸组　0. 9 g／kg　73. 97±17. 73**　8. 57±2. 47*＃　39. 88±6. 00**＃护卵颗粒高剂量组　11. 79 g生药／kg　52. 32±11. 82＃＃　7. 66±1. 88*＃＃　34. 56±5. 54*＃＃护卵颗粒中剂量组　5. 895 g生药／kg　64. 54±20. 08　7. 73±2. 72＃＃　37. 27±7. 00**＃护卵颗粒低剂量组　2. 9475 g生药／kg　80. 90±22. 84**　10. 64±3. 61*　39. 64±5. 78**＃

表4　护卵颗粒对卵巢功能减退模型大鼠卵巢指数的影响（±s，n＝10）

表4　护卵颗粒对卵巢功能减退模型大鼠卵巢指数的影响（±s，n＝10）

注：与空白对照组比较，*P＜0. 05，**P＜0. 01；与模型对照组比较，＃P＜0. 05，＃＃P＜0. 01。

组别　　剂量　　卵巢指数mg／g%　　子宫指数mg／g%空白对照组-50. 70±3. 43　211. 84±64. 40模型对照组　-　39. 32±3. 63**　165. 59±38. 78补佳乐组　0. 09mg／kg　46. 96±6. 40＃　207. 08±60. 78调经促孕丸组　0. 9g／kg　45. 15±4. 67＃　196. 69±67. 04护卵颗粒高剂量组　11. 79g生药／kg　47. 09±5. 13＃　202. 16±32. 55护卵颗粒中剂量组　5. 895g生药／kg　46. 87±6. 51＃　195. 61±52. 41护卵颗粒低剂量组　2. 9475g生药／kg　45. 24±5. 92＃175. 65±25. 15

图1　护卵颗粒卵巢功能减退模型大鼠卵巢结构形态学影响（HE，×100）

2. 6 对大鼠卵巢结构形态学变化 空白对照组卵巢可见各级卵泡及黄体分布，形态正常，成熟卵泡体积较大，卵泡液较多。模型对照组卵巢生长卵泡减少，原始卵泡较多，黄体数量少，闭锁卵泡多。补佳乐组与调经促孕丸组初级卵泡、生长卵泡增多，成熟卵泡可见。护卵颗粒高、中剂量组生长卵泡较模型对照组增多，出现较大直径的卵泡，闭锁卵泡减少。护卵颗粒低剂量组生长卵泡、成熟卵泡可见。结果见图1。

3　讨论

社会、心理因素对女性生殖健康的影响越来越受到关注，妇女易受身心应激的影响而导致月经失调闭经等妇科疾病发生。有调查研究心理因素是导致DOR及POF的中药原因之一，且长期的社会心理压力可能比短期的压力更能影响卵巢的功能［9-10］。肝主谋虑，性喜条达而恶抑郁，肝健则情志调畅，肝与情志密切相关。陈修园在《妇科要旨·种子篇》中云：妇人无子，皆由经水不调，经水所以不调者，皆由内有七情之伤，外有六淫之感，或气血偏盛，阴阳相乖所致。有学者提出心理应激从中医脏象理论分析当主要责之于肝［11］，肝气郁结证的客观化研究也提示［12］，肝气郁结证存在心理应激的障碍病理机制，涉及神经内分泌等调节网络。躯体和心理应激均能在下丘脑-垂体-卵巢轴（Hypothalamicpituitary-ovarianaxis，HPO）水平抑制或损害女性卵巢功能，导致女性生殖内分泌功能紊乱或下降，甚至卵巢早衰。肝郁主要由应激产生的一系列神经内分泌的变化来体现的，尤其是HPO在卵巢内分泌活动的周期性变化调控中居关键地位，并可能以单胺类递质的调节来实现在情志与生殖内分泌之间呈双向调节作用。

本实验采用重复制动应激建立肝郁型卵巢功能减退大鼠模型，慢性制动应激使动物自由行动受限，情绪受抑，比较接近中医“情志不遂”的病因。模型组大鼠水平活动及垂直活动减少，动情周期紊乱，血清中E2、PROG的含量显著降低，FSH、LH水平明显升高，下丘脑DA、NA、5-HT含量升高，提示应激状态下升高DA、NA、5-HT影响了中枢性腺对激素的分泌，引起了大鼠内分泌功能受损，说明造模成功。慢性应激能使大鼠活动减少，血清E2水平降低及FSH水平升高，能使大鼠卵巢各级卵泡数及黄体数减少［5，13-14］。在行为学研究中，旷场实验常用来考察动物在新奇环境中的活动度、探究行为、恐惧紧张状态及警觉性，肝郁证动物活动度明显减少［15］。HPO轴应激性紊乱与下丘脑-垂体-肾上腺轴（Hypothalamic - pituitary - adrenal Axis，HPA）轴应激性亢进密切相关，心理应激能激活HPA轴，并在下丘脑、垂体、卵巢3个水平影响女性生殖内分泌功能［16］，而儿茶酚胺类和5-HT被认为是应激最重要的神经递质［17-18］。FSH水平升高在卵巢功能下降时出现，它随卵巢功能及受孕能力的降低而升高［19］。E2可能是比FSH更早反应卵巢功能下降的指标［20］。实验结果表明，护卵颗粒各剂量组均能增加大鼠水平活动和垂直活动得分，明显降低下丘脑DA、NA、5-HT含量，并明显地升高DOR大鼠血清中E2、PROG的含量，降低FSH、LH水平，提示护卵颗粒可能通过参与调节HPO的内分泌功能，调节紊乱的单胺类递质水平，促进卵巢分泌E2，抑制下丘脑和垂体FSH和LH的分泌。病理结果亦表明，护卵颗粒各剂量组生长卵泡数和成熟卵泡数增多，闭锁卵泡明显减少。

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（2015 -05 -13收稿 责任编辑：张文婷）

中图分类号：R285. 5

文献标识码：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 035

通信作者：孙冬梅（1969—），女，硕士，博士生导师，主任中药师，研究方向：从事中药配方颗粒剂及中药新药研发，E-mail：tcmgdp＠163. com

作者简介：黄雪君（1981—），女，博士，副主任中药师，研究方向：从事中药药理及毒理研究，Tel：（020）83576735，E-mail：sharon510＠126. com

基金项目：广州市越秀区科技计划项目（编号：2013-CY-003）