肾上腺素对新生大鼠心肌细胞体积的影响及其作用机制

黄丹，李春梅，毛建文

(1广东药学院，广州 510006；2广东省生物活性药物研究重点实验室)



肾上腺素对新生大鼠心肌细胞体积的影响及其作用机制

黄丹1,2，李春梅1，毛建文1,2

(1广东药学院，广州 510006；2广东省生物活性药物研究重点实验室)

摘要：目的观察肾上腺素(Adr)对新生大鼠心肌细胞体积的影响，并探讨其机制。方法 原代培养新生大鼠心肌细胞，分为观察组和对照组，观察组加入Adr(1 μmol/L)，对照组加入等体积PBS，培养48 h。采用CountStar自动细胞计数仪测量各组心肌细胞体积变化；荧光显微镜观察心肌细胞氯通道蛋白3(ClC-3)荧光强度，在所有拍摄条件相同尤其是曝光时间相同的条件下对心肌细胞拍照，用Image Pro Plus分析软件定量分析心肌细胞ClC-3的平均光密度(AOD)；Western blotting法检测心肌细胞ClC-3。结果观察组及对照组心肌细胞体积分别为(964.80±60.00)、(716.28±57.49) μm3，心肌细胞ClC-3的AOD分别为0.037±0.012、0.062±0.009，心肌细胞ClC-3的相对表达量分别为0.372±0.027、1.040±0.210，两组比较，P均<0.05。结论 Adr能诱导新生大鼠心肌细胞肥大，其机制可能与下调ClC-3表达有关。

关键词：肾上腺素；心肌细胞；氯通道蛋白3；动物实验

心肌肥大是一种以心肌细胞体积增大为主要特征的缓慢而有力的代偿形式，然而它不是无限度的，长期持续的心肌肥大将引起心室功能异常，可能导致患者心力衰竭而死亡[1~3]。肾上腺素(Adr)是肾上腺髓质的主要激素，可与肾上腺素受体结合，介导儿茶酚胺作用，使心肌收缩力增强、传导加速及心输出量增多，长期反应会引起心肌细胞体积增大[4,5]，但其机制尚不完全明确。氯通道蛋白3(ClC-3)是电压门控的氯离子通道超级家族的一员，其参与细胞容积的调节，在维持细胞容积动态平衡中发挥重要作用[6,7]。本研究观察了Adr对新生大鼠心肌细胞体积的影响，并探讨其可能机制。

1材料与方法

1.1实验动物及试剂1～3日龄SD新生大鼠10只，均购自广州中医药大学实验动物中心。高糖DMEM培养基(Gibico公司)，FBS胎牛血清(Hyclone公司)，Adr、胰酶、脱脂奶粉(Sigma公司)，Tubulin抗体、鼠抗、兔抗(碧云天公司)，ClC-3抗体(Abcam公司)。

1.2新生大鼠心肌细胞培养、分组取SD新生大鼠10只，于75%乙醇中浸泡5～6 s迅速取出，用酒精棉球再次消毒胸腹部皮肤，剪开胸骨，挤出心脏。心脏用预冷的PBS洗两次，去除残留血液、结缔组织、心房组织及部分血管，再于PBS中将心脏剪碎，用胰蛋白酶冰上消化20 min，后移至37 ℃恒温磁力搅拌器上水浴，经多次消化，新生大鼠心脏消化成单细胞悬液，差速贴壁1 h后，取上清，加入0.1 mmol/L的5-溴-2′-脱氧尿苷，抑制成纤维细胞生长。用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，48 h后换无血清无双抗培养基，饥饿细胞16～24 h，后随机分为观察组和对照组，观察组加入Adr(1 μmol/L)，对照组加入等体积PBS。培养48 h。

1.3新生大鼠心肌细胞体积测量心肌细胞用PBS洗3次，用0.25%的胰酶消化细胞，终止消化后吹打混匀，加入CountStar细胞计数板中，每孔选择3个视野测量细胞直径，每组测量3次。

1.4新生大鼠心肌细胞ClC-3的平均光密度(AOD)分析吸弃培养基，PBS洗3次，固定15 min，吸除固定液，洗涤后加入封闭液，37 ℃下封闭1 h。加入ClC-3抗体(1∶100)4 ℃孵育过夜，移除抗体洗涤后加入ClC-3二抗，37 ℃孵育1 h，洗涤后DAPI染核，加入抗荧光淬灭剂，最后封片，用荧光显微镜观察，在所有拍摄条件相同尤其是曝光时间相同的条件下拍照，所得图片用Image Pro Plus分析软件定量分析心肌细胞ClC-3的AOD。

1.5新生大鼠心肌细胞ClC-3检测采用Western blotting法。提取心肌细胞总蛋白，用Qubit2.0荧光定量仪检测蛋白，调整蛋白上样量，SDS-PAGE电泳后转膜2 h，室温封闭2 h后加入一抗(Tubulin，1∶1 000；ClC-3，1∶1 000)4 ℃孵育过夜。TBS/T漂洗后加入相应二抗，室温孵育1 h。显影、定影后将胶片进行扫描，用Image J分析软件定量分析条带，以灰度值表示所得结果。

2结果

2.1两组新生大鼠心肌细胞体积变化观察组及对照组心肌细胞体积分别为(964.80±60.00)、(716.28±57.49)μm3，两组比较，P<0.05。

2.2两组新生大鼠心肌细胞ClC-3的AOD比较观察组及对照组心肌细胞ClC-3的AOD分别为0.037±0.012、0.062±0.009，两组比较，P<0.05。

2.3两组新生大鼠心肌细胞ClC-3的相对表达量比较观察组及对照组心肌细胞ClC-3的相对表达量分别为0.372±0.027、1.040±0.210，两组比较，P<0.05。

3讨论

心血管疾病是威胁人类健康的常见疾病，而心肌肥大是其发病率和病死率升高的重要因素之一[8]。心肌细胞体积增大，由代偿转为失代偿，最终可能导致患者因心力衰竭而死亡[9]。Adr是肾上腺髓质嗜铬细胞分泌的主要激素，属于儿茶酚胺类[10]。研究[11]显示，交感-儿茶酚胺系统参与高血压左室肥厚的形成。文献[12]报道，儿茶酚胺能够直接导致心肌肥大，促进肌球蛋白表达。另有研究[13]表明，在肥大心肌中，儿茶酚胺的合成减少而消耗增多。Adr与心肌肥大的形成有一定联系，但其具体机制目前尚不完全明确。

ClC-3主要存在于细胞器膜、突出囊泡、内体等[14]，参与细胞的容积调节，被认为是容积调节性氯通道的候选蛋白之一，细胞内Cl-向细胞外转运能影响细胞容积调节。当细胞发生肿胀后，容积激活性氯通道开放，Cl-外流，同时K-外流，渗透作用导致水分子外流，从而使细胞容积恢复[15]。除了参与细胞容积调节外，ClC-3还参与细胞电活动性、增殖、分化、迁移、凋亡和细胞内pH值调节[16]。最近研究[17]表明，ClC-3在心血管系统中如房室心肌细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞中也有丰富的表达[18,19]。用β-肾上腺素受体激动剂除了激活心肌细胞β-肾上腺素受体外，还能激活心肌氯通道[20]，在心肌肥厚、高血压、心肌缺血/再灌注、心脏衰竭中起重要作用。研究[21,22]发现，心脏特异性敲除ClC-3基因会导致成年鼠心肌肥大，提示ClC-3与心肌肥厚的发生有一定联系。本研究显示，观察组心肌细胞体积大于对照组，ClC-3的AOD、相对表达量降低，提示使用Adr后，心肌细胞内的某些基因或蛋白质表达量发生改变，从而引起一系列生化反应，最终导致心肌细胞肥大，而ClC-3能够参与细胞的容积调节，可能通过影响细胞内氯电流导致心肌细胞体积的增加。

总之，Adr能诱导新生大鼠心肌细胞肥大，其机制可能与下调ClC-3表达有关。

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Effect of adrenaline on volumes of cardiomyocytes in neonatal rats and its mechanism

HUANGDan1,LIChunmei,MAOJianwen

(1GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of adrenaline (Adr) on volumes of cardiomyocytes in neonatal rats and to investigate its mechanism. MethodsThe cardiomyocytes of neonatal rats were cultured in vitro and were divided into the observation group which was added with 1 μmol/L Adr for 48 h and the control group which was added with the same volumes of PBS for 48 h. The volume of cells were measured by CountStar. The fluorescence intensity of chloride channel protein 3 (ClC-3) protein was detected by immunofluorescence. The average optical density (AOD) of ClC-3 was measured by Image Pro Plus or Image J software. Western blotting was used to detect ClC-3. ResultsThe volume of cardiomyocytes in the observation group and the control group was (964.80±60.00) and (716.28±57.49) μm3respectively. The AOD in the two groups was 0.037±0.012 and 0.062±0.009. The ClC-3 protein expression in the two groups was 0.372±0.027 and 1.040±0.210. Significant difference was found between these two groups (all P<0.05).ConclusionAdr can induce the cardiac hypertrophy of neonatal rats, and the mechanism may be related with the down-regulated expression of ClC-3.

Key words:epinephrine; myocardial cells; chloride channel protein 3; animal experimentation

(收稿日期:2015-09-10)

中图分类号：R364.3

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)03-0020-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.007

通信作者简介：毛建文(1975-)，男，教授，主要研究方向为离子通道转化医学。E-mail: jianwenmao@hotmail.com

作者简介：第一黄丹(1991-)，女，硕士在读，主要研究方向为心血管药理。E-mail: huangdan_2009@163.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31500926)；广东省自然科学基金资助项目(2014A030310023)。