甜椒抗番茄斑点萎蔫病毒的种质创新

王立浩 张正海 毛胜利 曹亚从 堵玫珍 张宝玺

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）



甜椒抗番茄斑点萎蔫病毒的种质创新

王立浩 张正海 毛胜利 曹亚从 堵玫珍 张宝玺*

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

摘 要：番茄斑点萎蔫病毒病是我国辣椒生产的一种新兴和潜在重大威胁病害。利用引进的中国辣椒（Capsicum chinense Jack.）抗源材料PI152225，通过种间杂交和分子标记辅助回交选育，历时10年，将抗性基因Tsw转育到中椒系列骨干亲本一年生辣椒（Capsicum annuum L.）大果甜椒自交系0516中，创新材料0516（Tsw）的生长势和果实长度超过对照0516，商品性和配合力与骨干亲本0516差异不显著。

关键词：辣椒；番茄斑点萎蔫病毒；种间杂交；分子标记辅助育种

王立浩，副研究员，专业方向：辣椒遗传育种，E-mail：wanglihao@ caas.cn

致谢：感谢法国农业科学院Benoit Moury 博士帮助进行人工接种抗病性鉴定

番茄斑点萎蔫病毒（TSWV）是我国辣椒生产的重大潜在病害。该病毒在世界上广泛分布，是北美、欧洲等地辣椒生产的首要病毒，巴西（Boiteux et al.， 1993a）、美国（Hobbs et al.，1994）、意大利（Roggero et al.， 2002）、澳大利亚（Sharman & Persley， 2006）、韩国（Mun et al.， 2008）相继报道，给辣椒生产带来巨大损失，严重的时候可以造成绝收。我国近年来也有云南辣椒上发现了番茄斑点萎蔫病毒的报道（佟爱仔，2012）。番茄斑点萎蔫病毒是由蓟马专型传播的一种病毒病，我国在2000年前后首次发现西花蓟马（王立浩，2003；张友军等，2003），之后西花蓟马在全国范围内流行，目前在广东、海南、云南露地，以及北方的山东、北京等地温室危害严重。随着西花蓟马的流行传播，番茄斑点萎蔫病毒对辣椒的危害有加重的趋势。据中国农业科学院蔬菜花卉研究所辣椒课题组对北京地区病毒病的监测，发现在近5年来至少有两年辣椒上暴发过番茄斑点萎蔫病毒，并进行了ELISA（酶联免疫）鉴定（待发表）。

辣椒中TSWV的抗源材料并不丰富，一年生辣椒（Capsicum annuum L.）缺乏抗病毒资源。Boiteux等（1993b）鉴定了70份不同种辣椒材料，仅从2份C.chinense Jack.（中国辣椒）材料中鉴定出具有过敏性反应的显性单基因抗性。Black等（1996）称PI152225（C.chinense）和PI159236（C.chinense）中TSWV抗性是由同一个基因 Tsw控制的。Moury等（2000）开发了1个与PI152225中抗性基因Tsw紧密连锁的CAPS标记，可以应用到辅助育种中。基因 Tsw是辣椒中已知的唯一一个抗番茄斑点萎蔫病毒基因，Hoang等（2013）鉴定出1份新的抗源材料AC09-207（C.chinense），由单显性基因控制，抗病基因是否是Tsw还不确定。

目前国内外抗番茄斑点萎蔫病毒的甜辣椒自交系和品种还未见报道。根据对其发病规律的认识，本课题组前瞻性地提出了种质创新计划。由于缺乏抗病资源，在本研究开始之初，病原没有被分离，且抗病接种鉴定在国内存在困难，因此TSWV的抗性育种具有很大困难。

1　材料与方法

1.1试验材料

甜椒0516（C.annuum L.）为本课题组选育的大果自交系，群体整齐，综合性状优良，具有较高的配合力，是中椒系列的骨干亲本，但对番茄斑点萎蔫病毒敏感。PI152225属于中国辣椒（C.chinense），2003年由法国农业科学院Alain Palloix博士提供，群体整齐，分枝性强，果实小（横径1.6cm，纵径4.0cm），含有Tsw基因，高抗番茄斑点萎蔫病毒（人工接种抗性鉴定表现免疫），但在我国北方地区种植时植株结果性差，同一年生辣椒杂交亲和性低。将PI152225作为抗番茄斑点萎蔫病毒的辣椒抗源材料。

1.2种间杂交和整体种质创新过程

自2007年开始，利用2份材料进行种间杂交，以0516为母本，以PI152225为父本，获得F1。继而利用0516为回交亲本进行回交，利用CAPS分子标记进行回交后代的选择（Moury et al.，2000），同时进行园艺性状的选择。经过5代回交和3代自交获得材料12P80，命名为“0516（Tsw）”。测定各个育种世代的果实大小和单果质量。在法国农业科学院进行回交5代和育成自交系的番茄斑点萎蔫病毒人工接种抗性鉴定。从2013年开始试配组合，进行配合力测试和番茄斑点萎蔫病毒人工接种抗性鉴定，筛选出优良组合进行品种比较试验，小区面积4.7 m2，随机区组设计，3次重复。利用Excel软件进行方差分析。

1.3分子标记辅助选择

基因组DNA的提取与检测：提取回交后代及自交分离群体单株的DNA，用于检测供筛选分子标记的多态性。采用改良的CTAB小量法提取辣椒基因组DNA（Fulton et al.，1995）。用Biospec-nano微量分光光度计检测所提DNA质量和浓度，将DNA稀释至50 ng·µL-1备用。种间杂交和分子标记辅助选择的育种技术体系：在回交和自交基因分离世代（图1），以单株DNA为样本，进行CAPS标记检测，PCR反应体系参见Moury等（2000）。PCR产物的检测：取3μL PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，或用1.5%琼脂糖凝胶检测。

图1　0516（Tsw）的回交转育系谱图MAS：分子标记辅助选择。

1.4番茄斑点萎蔫病毒抗性鉴定

2014年将自交系和配制组合在法国农业科学院Benoit Moury博士实验室进行TSW病毒人工接种抗性鉴定。TSW病毒采用普遍流行株系。鉴定方法参考Moury等（2000）。每个材料接种30株，接种21 d后进行调查。

2　结果与分析

2.1种质创新过程和果实性状

自交系PI152225和自交系0516杂交亲和力低，产籽率低，仅获得少数几粒饱满种子。对回交世代进行SCAR分子标记选择（图2）和园艺性状的选择。分析选育过程中的果实大小和单果质量（图3、4）。在回交1代至3代，果实大小和单果质量缓慢增加，至回交4代和5代，果实的大小和单果质量快速提高，但方差较大，说明群体内基因尚未纯化。经过2代自交之后，果实大小基本稳定到回交亲本水平，方差变小，材料趋于纯和（图5～8）。

图2　CAPS标记分子标记辅助选择回交世代（BC2）的图谱M，DNA Marker；S，Tswv感病连锁标记单株；R，Tswv抗病连锁标记单株；*，缺失数据；1.5%琼脂糖凝胶，EB染色。

2.2创新材料的植物学特点

创新材料0516（Tsw）花期节位整齐，平均单果质量与轮回亲本相比有所提高，但差异不显著；果实纵径较轮回亲本增长15.7%，差异显著；植株生长势得到显著提高（图9、10，表1）。

2.3创新材料的配合力

分别利用0516（Tsw）、0516作父本，与甜椒自交系77013杂交进行F1产量比较（77013×0516即目前的主栽品种中椒105号）。2013～2014年77013×0516（Tsw）平均产量3 900.5kg·（667 m2）-1，比对照中椒105号增产8.27%；77013×0516（Tsw）单果质量为101 g，对照为107 g。创新材料的植株长势强，果实商品性和果实大小优于中椒105号。

2.4创新材料和配制组合对番茄斑点萎蔫病毒的抗性

2012年本所农场大棚辣椒发生病毒病，其中PI152225和转育中的0516（Tsw）〔BC5（0516×PI152225）S2〕表现抗病，其余材料（包括0516）均表现感病，经鉴定该病毒为番茄斑点萎蔫病毒（图11、12）。2014年委托法国农业科学院进行番茄斑点萎蔫病毒人工接种抗性鉴定，0516（Tsw）和 77013×0516（Tsw）均表现抗病，0516和中椒105（77013×0516）均表现感病（表2，图13）。

图3　选育过程中果实长度和宽度的群体变化

图4　选育过程中单果质量的群体变化

表1　转育自交系与回交亲本的植株性状

表2　人工接种鉴定番茄斑点萎蔫病毒鉴定结果

3　结论与讨论

本研究的甜椒资源创新实现了分子标记辅助育种同常规育种的结合，是分子标记辅助育种的一个应用实例。通过分子标记辅助育种，在回交5代过程中，准确地选择含有抗病基因的材料，省去了中间转育世代人工接种抗性鉴定，避免了通过表观性状选择可能出现的失误。在回交世代中，由于采用了分子标记辅助选择，在田间选择过程中可以更多关注其他园艺性状的选择，加快了材料园艺性状优化的速度。试验结果表明，回交4代的群体果实大小已经接近回交亲本。目前已利用创新材料0516（Tsw）配制了多个组合。

到目前为止，辣椒中仅在中国辣椒中发现了Tsw这一个单基因的番茄斑点萎蔫病毒抗性基因。本文是利用种间杂交获得的抗番茄斑点萎蔫病毒甜椒自交系。抗番茄斑点萎蔫病毒甜椒自交系的育成将对我国该病毒的防治起到重要作用。不断鉴定筛选新的抗源基因是实现抗病资源创新和新品种选育所需要的。番茄斑点萎蔫病毒的变异可能克服该抗病基因（Tsw），这将会给育种工作带来新的挑战。

图5　BC1（0516×PI152225）的群体果实

图6　BC5（0516×PI152225）S2的群体果实

图7　抗源材料PI152225（C.chinense）

图8　自交系0516果实和转育自交系0516（Tsw）的果实

图9　自交系0516

图10　自交系0516（Tsw）

图11　番茄斑点萎蔫病毒（TSWV）侵染辣椒果实症状（2012年本所农场大棚）

图12　田间普遍发生番茄斑点萎蔫病毒（TSWV）时各材料的抗病情况（2012年本所农场大棚）a，抗源材料PI152225，抗病；b，甜椒自交系0516，感病；c，甜椒自交系BC5（0516×PI152225）S2，抗病；d，其他28份甜椒材料，感病。

跋：有感《中国蔬菜》2010年第1期卷首“一位98岁老人的心愿”，谨以此文向李鹏飞教授致敬！

图13　TSWV人工接种抗病性鉴定结果a，中椒105号；b，0516；c，0516（Tsw）；d， 77013×0516（Tsw）。

参考文献

佟爱仔，赵兴能，孔宝华，陈海如，蔡红.2012.侵染云南烟草的番茄斑萎病毒（TSWV）的RT-PCR检测.云南农业大学学报，（6）：809-813.

王立浩.2003.外来入侵害虫——西花蓟马在北京等地辣椒上的暴发.中国蔬菜，（5）：7.

张友军，吴青军，徐宝云，朱国仁.2003.危险性外来入侵生物——西花蓟马在北京发生危害.植物保护，29（4）：58-59 Black L L，Hobbs H A，Gatti J M.1996.Tomato spotted wilt virus resistance in Capsicum chinense PI152225 and 159236.Plant Disease，75：863.

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Roggero P， Masenga V， Tavella L.2002.Field isolates of Tomato spotted wilt virus overcoming resistance in pepper and their spread to other hosts in Italy.Plant disease， 86（9）：950-954.

Sharman M， Persley D M.2006.Field isolates of Tomato spotted wilt virus overcoming resistance in Capsicum in Australia.Australasian Plant Pathology， 35（2）：123-128.

Innovation of Sweet Pepper（Capsicum annuum L.）Germplasm Resource with Resistance to Tomato spots wilt virus

WANG Li-hao，ZHANG Zheng-hai，MAO Sheng-li，CAO Ya-cong，DU Mei-zhen，ZHANG Bao-xi*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：Tomato spots wilt virus is a serious disease affecting pepper production in China.It is also a new and high potential threat to pepper production.Using resistant material PI152225 of imported pepper（Capsicum chinense Jack.），this study has conducted backcross via interspecies crossing and molecular markers assisted breeding for 10 years，and successfully introduced the resistant gene Tsw into the inbred line 0516 of sweet pepper（Capsicum annuum L.）with large fruit.The growth vigor and fruit length of this innovated material 0516（Tsw）has surpassed that of the contrast.There were no significant differences in their commodity nature and coordinate ability.

Key words：Pepper；Tomato spots wilt virus；Interspecies crossing；Molecular markers assisted breeding

基金项目：国家“863”计划项目（2012AA100103002），农科院创新工程项目（CAAS-ASTIP-IVFCAAS），农业部大宗蔬菜体系项目（CARS-25），公益研究所基金项目（ICS，CAAS）（1610032011011）

收稿日期：2015-12-23；接受日期：2016-01-12

*通讯作者（

Corresponding author）：张宝玺，研究员，专业方向：遗传育种，E-mail：zhangbaoxi@caas.cn