超滤法和HPLC法测定14-去氧穿心莲内酯的血浆蛋白结合率

张二锋， 赵军利， 杨 静， 孙瑞洁， 韩 光（河南大学药物研究所，河南开封475004）



超滤法和HPLC法测定14-去氧穿心莲内酯的血浆蛋白结合率

张二锋， 赵军利， 杨 静， 孙瑞洁， 韩 光*
（河南大学药物研究所，河南开封475004）

摘要：目的 测定14-去氧穿心莲内酯在大鼠与人血浆中的蛋白结合率。方法 超滤法和HPLC法测定14-去氧穿心莲内酯在大鼠与人血浆中的血浆蛋白结合率。结果 14-去氧穿心莲内酯与大鼠和人血浆中的平均血浆蛋白结合率分别为（93.88±2.16）和（95.55±0.83）%。结论 14-去氧穿心莲内酯与大鼠和人血浆蛋白均具有很强的结合能力，而且无明显的浓度依赖性。

关键词：14-去氧穿心莲内酯；血浆蛋白；结合率；超滤；HPLC

穿心莲为爵床科穿心莲属植物穿心莲Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees的干燥地上部分，《中国药典》2010版一部记载，其性寒，味苦，归心、肺、大肠、膀胱经，具有清热解毒，凉血消肿功效［1］，其有效成分为穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯等二萜内酯类化合物。现代药理研究表明，14-去氧穿心莲内酯具有抗炎、抗癌、抗钩端螺旋体病、治疗酒精肝、抗菌等作用［2-10］。吴阳等［11］发现，脱水穿心莲内酯与牛血清白蛋白、正常人血浆、大鼠血浆的血浆蛋白结合率分别为（71.50±1.50）%、（79.91±2.51）%、（82.41± 2.05）%，属于中等强度的结合，但目前尚无关于14-去氧穿心莲内酯与血浆蛋白结合率的研究报道。药物血浆蛋白结合率可直接影响药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄，从而影响其作用强度与时间，是药代动力学、分子药理学等学科研究的重要课题之一［12］。本实验采用超滤法和HPLC法测定14-去氧穿心莲内酯与大鼠和人血浆的血浆蛋白结合率，为该成分的临床合理应用与相关新药研发提供可靠的依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC-20AT HPLC色谱仪，包括CLASS-VP色谱工作站、紫外检测器（日本岛津公司）；精密移液器（大龙兴创实验仪器北京有限公司）；KQ-300VDE双频数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；NanosepI10KDa超滤管（美国Pa11公司）；TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；MaxiMix P1us漩涡混合器（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 药品与试剂 14-去氧穿心莲内酯对照品（自制，结构经各波谱手段确认和HPLC法测定，按面积归一化法计算，纯度在99.5%以上）；14-去氧穿心莲内酯样品（自制，纯度在98.0%以上）；肝素钠（江苏万邦生化医药股份有限公司，批号1307132）；正常人血浆（开封市中心血站）。乙腈为色谱纯（天津市四友精细化学品有限公司）；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

1.3 动物 SD大鼠，雄性，体质量（200±20）g（河南省实验动物中心，合格证号SCXK［豫］2010-0002）。取健康SD大鼠5只，乙醚麻醉，75%酒精消毒，摘除眼球取血，置于肝素化的EP管中，4 000 r/min离心15 min，然后将上清液（血浆）转移到另一EP管中，保存于4℃冰箱中，备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ST Pak C18-ES色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），包括预柱（50 mm×4.6 mm，北京迪马科技有限公司）；流动相为乙腈-水（40∶60）；体积流量为1.0 mL/min；检测波长为205 nm；柱温为室温；进样体积为20 μL。在该条件下，空白血浆中的内源物质不干扰主成分测定，专属性较好，见图1。

2.2 磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH＝7.4）的配制 取磷酸二氢钾1.36 g，加入0.1 mo1/L氢氧化钠溶液79 mL，蒸馏水稀释至200 mL，即得。

2.3 对照品溶液的配制 精密称取对照品10.02 mg，置于10 mL量瓶中，加入甲醇适量，超声溶解，甲醇定容至10 mL，摇匀。精密吸取5 mL，置于25 mL量瓶中，PBS液定容，摇匀，即得。

2.4 标准曲线的制备 分别精密吸取“2.3”项下对照品溶液0.005、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mL，置于10 mL量瓶中，PBS液定容，摇匀，过0.22 μm滤膜，进样20 μL。然后，以峰面积（A）对质量浓度（C）作回归，得到标准曲线A＝41 168C-6 218.2（r＝0.999 9），表明在0.100 2～20.04 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度 分别精密配制质量浓度为4.008、10.02、20.04 μg/mL的14-去氧穿心莲内酯溶液，PBS液定容，摇匀，过0.22 μm滤膜，进样20 μL，测定峰面积ISD值。日内精密度分别在2、4、6、8、10 h进样测定，而日间精密度分别在第1、2、3、4、5天进样测定，结果见表1，表明仪器精密度良好。

表1 14-去氧穿心莲内的精密度

图1 超滤液的HPLC色谱图

2.6 超滤膜回收率的考察 PBS液配制质量浓度分别为2.00、4.00、10.00 μg/mL的标准品溶液500 μL，置于超滤离心管超滤膜上，6 000 r/min离心30 min，取20 μL进样测定，代入“2.4”项下标准曲线方程，计算回收率。结果，14-去氧穿心莲内酯的回收率均大于93%，说明超滤膜对其没有特异性吸附。

2.7 温孵时间的考察 模拟人体体温37℃的孵化时间，分别温孵20、40、60、80、120、150 min。最终确定，温孵120 min时，药物与蛋白达到结合平衡状态。

2.8 血浆蛋白结合率试验 精密吸取标准品溶液30、50、100 μL，置于1.5 mL EP管中，分别加入大鼠与人血浆970、950、900 μL，涡旋1 min，37℃下恒温水浴中温孵2 h。然后，移取0.5 mL置于超滤管中，6 000 r/min离心30 min，取20 μL进样测定，将峰面积代入标准曲线方程，计算14-去氧穿心莲内酯的质量浓度，求出其血浆蛋白结合率，计算公式如下，结果见表2。

（ρ超滤前为超滤前14-去氧穿心莲内酯的质量浓度，ρ超滤后为超滤后14-去氧穿心莲内酯的质量浓度）

表2 14-去氧穿心莲内酯与大鼠和人血浆的血浆蛋白结合率（±s，n＝3）

表2 14-去氧穿心莲内酯与大鼠和人血浆的血浆蛋白结合率（±s，n＝3）

质量浓度/ （μg·mL-1）大鼠血浆蛋白结合率/%人血浆蛋白结合率/% 6.012　91.20±4.03　93.87±1.33 10.02　94.30±1.39　95.77±0.43 20.04　96.14±1.06　97.02±0.73平均值93.88±2.16　95.55±0.83

由表可知，14-去氧穿心莲内酯与大鼠和人血浆均具有很强的结合能力，并且在所考察的质量浓度范围内，无明显的浓度依赖性。

3 讨论

研究药物血浆结合率的方法有超滤法、平衡透析法、超速离心法、凝胶过滤法等［12］，其中较常用的为平衡透析法与超滤法，但前者耗时较长，可能引起药物代谢降解，对药物蛋白结合率的测定造成较大误差，而后者不仅操作方便简便，而且测定速度快，样品用量少。因此，本实验选择超滤法［13］。

另外，本实验考察了药物模拟人体体温37℃的孵化时间，发现药物在温孵120 min时，与蛋白达到结合平衡状态。同时，还研究了超滤离心的转速和时间，根据不漏蛋白，而且超滤液体积与超滤前总体积之比为0.3～0.6为宜的标准［14］，最终确定离心时间为30 min，转速为6 000 r/min。

实验显示，14-去氧穿心莲内酯的平均蛋白结合率在93%以上，属于高蛋白结合［15］，表明如果在临床上与其它药物联合使用，容易产生安全性问题。因此，有必要选择临床上联合使用并具有高蛋白结合率的药物，开展体外药物蛋白竞争结合实验，用于保证人体用药的安全性。

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*通信作者：韩 光（1966—），女，博士，教授，硕士生导师，研究方向为天然活性成分研究及新药开发。Te1：（0371）23880680，E-mai1：hang@henu.edu.cn

作者简介：张二锋（1988—），男，硕士，研究方向为天然活性成分研究及新药开发。Te1：15136226020，E-mai1：779354666@qq.com

基金项目：国家自然科学基金项目（81373974）；河南大学研究生教育综合改革项目（Y1319023）

收稿日期：2015-01-27

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.047

中图分类号：I969.1

文献标志码：B

文章编号：1001-1528（2016）03-0689-03