丹皮酚对醛固酮诱导心脏成纤维细胞增殖的影响

徐 倩， 杜 超， 苏花卫， 周晓慧*， 肖艳红， 王 畅（.承德医学院，河北承德067000；.承德石油高等专科学校，河北承德067000）



丹皮酚对醛固酮诱导心脏成纤维细胞增殖的影响

徐 倩1， 杜 超1， 苏花卫2， 周晓慧1*， 肖艳红1， 王 畅1
（1.承德医学院，河北承德067000；2.承德石油高等专科学校，河北承德067000）

摘要：目的 观察丹皮酚对醛固酮诱导心脏成纤维细胞增殖的抑制作用，以及对核转录因子κB抑制剂-α（IκB-α）、基质金属蛋白酶9（MMP9）表达的影响，探讨其抗心室重构的可能的分子机制。方法 将培养的心脏成纤维细胞分为正常对照组，醛固酮组，丹皮酚低、中、高剂量组，卡托普利组，通过MTT法检测各组成纤维细胞（FBCs）活性，采用Western b1ot法检测各组FBCs中IκB-α、MMP9蛋白的表达情况。结果 与正常对照组比较，醛固酮组FBCs活力明显升高（P＜0.01）。与醛固酮组相比，丹皮酚低剂量组无明显变化（P＞0.05），丹皮酚中、高剂量组和卡托普利组的细胞活力明显降低（P＜0.01）。与正常对照组比较，醛固酮组FBCs中IκB-α蛋白表达明显降低（P＜0.01）。与醛固酮组相比，丹皮酚各剂量组、卡托普利组的IκB-α蛋白表达明显增强（P＜0.01）。与正常对照组比较，醛固酮组FBCs中MMP9蛋白表达明显增强（P＜0.01）。与醛固酮组相比，丹皮酚各剂量组、卡托普利组的MMP9蛋白表达明显降低（P＜0.01）。结论 丹皮酚对醛固酮诱导的FBCs增殖具有抑制作用，其机制可能与上调FBCs中IκB-α蛋白表达，下调MMP9蛋白表达有关。

关键词：丹皮酚；心脏成纤维细胞；IκB-α；MMP9

慢性充血性心力衰竭是各种严重心脏疾病最后阶段所表现出来的症状，严重危害患者的身体健康。近年来，研究表明心室重构在心衰发生、发展的过程中发挥着不可或缺的作用。醛固酮（a1dosterone，ALD）可诱发心肌纤维化，促进胶原合成，促进心室重构。

文献报道丹皮酚在整体水平改善大鼠心梗后的心室重构，但未有细胞水平的报道。本研究以新生大鼠心脏成纤维细胞（fibrob1ast ce11s，FBCs）为研究对象，以醛固酮为诱导因子建立成纤维细胞增殖模型，首次在细胞水平观察丹皮酚对醛固酮诱导的成纤维细胞增殖的干预作用，确证丹皮酚对心室重构的改善作用。探讨醛固酮诱导心脏成纤维细胞增殖的可能的分子机制，为防止使用药物干预和逆转心室重构提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 胰蛋白酶、醛固酮、MTT均购自美国Sigma公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司。丹皮酚购自宁波天真制药有限公司，批号为20110603。IκB-α一抗购自美国Santa cruz公司；IκB-α二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；MMP9一抗购自美国Santa cruz公司；MMP9二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；β-Actin一抗、二抗均购自美国Santa cruz公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器 HEIAce11 150I型CO2培养箱购自德国Heraeus公司；CKX415F型倒置显微镜购自日本O1ympus公司；SW-CJ-2FD净化工作台购自上海博讯实业有限公司；CC6离心机购自北京鼎昊源科技有限公司。

1.3 大鼠心脏成纤维细胞原代及传代培养 取新出生1～3 d的乳鼠20～30只，用75%的酒精消毒并处死。取乳鼠心脏的大部分放入D-Hanks液中，反复清洗组织，以去掉其中的血管。将心脏组织剪碎，放入三角烧瓶内，加入20～30倍组织体积的胰酶消化液，磁力搅拌器上搅拌8 min，转移消化液至离心管内，加入4～5滴小牛血清使胰酶灭活。消化过程可重复7～8次，直至组织消化完全。1 000 r/min离心10 min，用D-Hanks液洗细胞。重复离心操作1次。用含10%胎牛血清的培养基将细胞重悬，接种在培养瓶内，培养90 min后取出培养瓶，将培养液弃去，再加入10%胎牛血清的培养基继续培养。待心脏成纤维细胞达80%融合，用D-Hanks液冲洗细胞2次，加入1 m L 0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA（乙二胺四乙酸）混合消化液消化传代。

1.4 实验分组 实验用第3代细胞，实验分组如下。①正常对照组。加DMEM培养基（含5%胎牛血清）；②醛固酮组。加含10-7mo1/L醛固酮、5%%胎牛血清的DMEM培养基；③丹皮酚低剂量组。加含5%胎牛血清、10-7mo1/L醛固酮、0.15 mmo1/L丹皮酚的DMEM培养基；④丹皮酚中剂量组。加含5%胎牛血清、10-7mo1/L醛固酮、0.3 mmo1/L丹皮酚的DMEM培养基；⑤丹皮酚高剂量组。加含5%胎牛血清、10-7mo1/L醛固酮、0.6 mmo1/L丹皮酚的DMEM培养基；⑥卡托普利组。加含5%胎牛血清、10-7mo1/L醛固酮、1 mg/mL卡托普利的DMEM培养基。

1.5 MTT法检测细胞活性 原代培养的心脏成纤维细胞达到85%融合后，0.08%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化成单细胞悬液，调整细胞悬液密度为1.0×105/mL，接种于96孔板，每孔200 μL，待细胞达到85%融合时，除弃原培养液，每孔加入无胎牛血清的DMEM培养基200 μL，使细胞同步化。24 h后，按实验分组施加干预因素。每组设6个复孔。同时设只有培养液的空白对照。CO2培养箱培养1 d后，每孔加入20 μLMTT（5 mg/mL），培养4 h，用移液器吸掉上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡溶解后，在波长490 nm下，酶标仪测定各孔的吸光度值（A）。

1.6 Western b1ot检测各组FBCs中IκB-α、MMP9蛋白的表达 将第3代各分组FBCs以1.0×108/L密度接种于25 cm2培养瓶，待细胞达到约85%融合时，提取细胞总蛋白。每瓶约加入细胞裂解液160 μL，用BCA法测定总蛋白浓度。取35 μg蛋白样品，SDS-PAGE电泳，5%的浓缩胶，12%的分离胶（IκB-α、β-Actin），8%的分离胶（MMP9），转膜120 min，5%进口脱脂奶粉封闭过夜，1∶200稀释的IκB-α、MMP9一抗4℃孵育至少2 h，与1∶5 000稀释的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜15、10、10 min后，与ECL作用3 min，在暗室显影。

2 结果

2.1 MTT法检测各组FBCs活力 模型组醛固酮组FBCs活力明显升高（P＜0.01）。而加入不同质量浓度的丹皮酚后，高剂量组细胞活力明显降低（P＜0.01），而且高剂量组细胞活力几乎与阳性对照卡托普利组无差别（P＞0.05）。结果见表1。

2.2 Western b1ot检测各组FBCs中IκB-α蛋白的表达 醛固酮组IκB-α蛋白表达明显降低（P＜0.01）。加入不同质量浓度的丹皮酚后，各剂量组IκB-α蛋白表达增强（P＜0.01），而且高剂量组细胞活力几乎与阳性对照卡托普利组无差别（P＞0.05）。结果见图1、表2。

表1 各组FBCs活力（±s，n＝6）

表1 各组FBCs活力（±s，n＝6）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与醛固酮组比较，△△P＜0.01

组别　　吸光度值（A）正常对照组0.375 4±0.024 2醛固酮组　0.647 6±0.028 9**丹皮酚低剂量组　0.613 8±0.031 9丹皮酚中剂量组　0.536 9±0.035 2△△丹皮酚高剂量组　0.457 2±0.032 4△△卡托普利组　0.419 3±0.034 6△△

图1 各组FBCs中IκB-α蛋白的表达水平

表2 各组FBCs中IκB-α蛋白的表达水平（±s，n＝6）

表2 各组FBCs中IκB-α蛋白的表达水平（±s，n＝6）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与醛固酮组比较，△△P＜0.01

组别　IκB-α/β-Actin正常对照组1.304 9±0.028 3醛固酮组　0.216 4±0.024 5**丹皮酚低剂量组　0.423 8±0.031 9△△丹皮酚中剂量组　0.445 1±0.036 2△△丹皮酚高剂量组　1.126 9±0.028 4△△卡托普利组　1.198 3±0.031 7△△

2.3 Western b1ot检测各组FBCs中MMP9蛋白的表达 醛固酮组FBCs中MMP9蛋白表达明显增强（P＜0.01），加入不同质量浓度的丹皮酚后，各剂量组MMP9蛋白表达明显降低（P＜0.01）。结果见图2、表3。

图2 各组FBCs中MMP9蛋白的表达水平

表3 各组FBCs中MMP9蛋白的表达水平（±s，n＝6）

表3 各组FBCs中MMP9蛋白的表达水平（±s，n＝6）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与醛固酮组比较，△△P＜0.01

组别　MMP9/β-Actin正常对照组0.814 6±0.031 4醛固酮组　2.623 9±0.027 8**丹皮酚低剂量组　2.573 8±0.032 3△△丹皮酚中剂量组　2.524 3±0.035 9△△丹皮酚高剂量组　2.106 5±0.031 6△△卡托普利组　1.514 7±0.026 5△△

3 讨论

心肌细胞数量的减少和细胞形态的变化是心室重构最主要的特征，此外还包括细胞间质成分、含有量的变化。心室重构主要是指心室结构的改变，一般表现为成纤维细胞增殖、心肌细胞肥大、胶原组织增生［1］。心室重构可增加心肌僵硬度，降低心肌顺应性，最终导致心律失常、心力衰竭等［2］。心室重构常继发于心肌梗死，可严重影响心脏的功能。在心力衰竭发生和发展的全过程中都存在着心室重构，心室重构是细胞形态和基因表达的改变，其中心脏大小和功能的改变是其在临床上的主要表现［3］。

醛固酮（a1dosterone，ALD）是肾上腺皮质合成并分泌的盐皮质激素，是一种类固醇激素，可调节钠、钾代谢。醛固酮可促进成纤维细胞增殖［4］，促进胶原合成，诱发室性心律失常，因此研究表明醛固酮是心血管疾病新的危险因素之一［5］。

丹皮酚（paeono1，Pae）又名牡丹酚，可从牡丹皮、徐长卿等中药中提取得到。丹皮酚药理活性众多，文献报道丹皮酚可抗心律失常、保护心脏［6］。本研究采用新生大鼠心脏成纤维细胞为研究对象，以醛固酮为诱导因子建立成纤维细胞增殖模型，探讨丹皮酚是否抑制成纤维细胞的增殖及其发挥作用的可能的分子机制。

本研究采用10-7mo1/L醛固酮作用于FBCs，使细胞增殖。研究结果显示，醛固酮组FBCs增殖显著，光镜下可见FBCs密度增大，数量增多。丹皮酚中高剂量组细胞活力降低，细胞数量减少。并且丹皮酚高剂量组的细胞活力与阳性对照卡托普利组几乎无差别。这说明丹皮酚可以抑制FBCs的增殖。

近年来研究结果表明，炎症反应对于慢性充血性心衰的发生发展具有重要作用［7］。文献报道核转录因子NF-κB在炎症反应过程中发挥重要的调控作用。一般情况下，在细胞质中，NF-κB与IκB结合在一起，呈非活性状态［8］。细胞受到刺激后，IκB激酶被激活，IκB磷酸化泛素化后被降解，NF-κB从多聚体上解离出来，进入细胞核，与模板DNA结合在一起，从而调控细胞因子、黏附分子等的基因表达［9］，使细胞因子、黏附分子表达增多［10］。

NF-κB可以通过调控基质金属蛋白酶（matrix meta11oproteinases，MMPs）表达来调节细胞外基质代谢［11-12］，进而调节心脏成纤维细胞增殖。MMPs是一类降解细胞外基质蛋白成分的重要酶系［13］，因发挥作用时需要Ca2＋、Zn2＋等金属离子而得名［14］。MMP9是基质金属蛋白酶的重要成员之一，可降解细胞外基质的胶原和明胶。

本研究结果显示，醛固酮组IκB-α蛋白的表达降低，MMP9蛋白表达增强；而用丹皮酚干预后IκB-α蛋白的表达增强，MMP9蛋白表达降低。这表明丹皮酚可抑制IκB-α蛋白的降解，抑制其下游MMP9的表达，也就是说丹皮酚可能抑制NF-κB通路的基因蛋白表达，从而抑制心脏成纤维细胞增殖。

综上所述，丹皮酚对醛固酮诱导的FBCs增殖具有抑制作用，其机制可能与影响FBCs中NF-κB通路中MMP9、IκB-α的蛋白表达有关。本研究将为把中药丹皮酚开发成抗心衰的新药提供理论和实验依据。

参考文献：

［1］ 杜 超，周晓慧，徐 倩，等.血管紧张素系统对心室重构的影响［J］.医学信息，2014，27（3）：549.

［2］ 张瑞英，孙艺红，富 路，等.血管紧张素转换酶抑制剂和AT1受体拮抗剂联合应用对大鼠心室重构影响的实验研究［J］.中国实用内科杂志，2005，25（1）：36-38.

［3］ CohrJN，Ferrari I，Sharpe N.Cardiac remode1ing-concepts and c1inica1imp1ication：a consensus paper from an internationa1 forum on cardiac remode1ing.Beha1f of an internationa1 forum on cardiac remode1ing［J］.JAm Coll Cardiol，2000，35（3）：569-582.

［4］ Neumann S，Huse K，Semrau I，etal.A1dosterone and D-g1ucose stimu1ate the pro1iferation of human cardiac myofibrob1asts in vitro［J］.Hypertension，2002，39（3）：756-760.

［5］ Iocha I，Wi11amsGH.Iationa1e for the use of a1dosterone antagonists in congestive heart fai1ure［J］.Drugs，2002，62（5）：723-731.

［6］ 张 艳，范俊安.中药材牡丹皮研究概况Ⅳ丹皮药理作用研究概况［J］.重庆中草药研究，2009，6（1）：24-31.

［7］ Parish I C，Evans JD.Inf1ammation in chronic heart fai1ure ［J］.Ann Pharmacother，2008，42（7）：1002-1016.

［8］ Kausha1V，Sch1ichter L C.Mechanisms ofmicrog1ia-mediated neurotoxicity in a new mode1of the stroke penumbra［J］.JNeurosci，2008，28（9）：2221-2230.

［9］ 徐 倩，周晓慧，曹 凯，等.同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞IκB和NF-κB表达的影响［J］.天津医药，2011，39 （5）：438-441.

［10］ Bond M，Baker A H，Newby A C.Nuc1ear factor-kappaB activity is essentia1 formatrixmeta11oproteinase-1 and -3 upregu1ation in rabbit derma1 fibrob1asts［J］.Biochem Biophys Res Commun，1999，264（2）：561-567.

［11］ Wu C Y，Wu C J，Tseng C C，et al.He1icobacter py1ori promote gastric cancer ce11s invasion through a NF-κB and COX-2-mediated pathway［J］.World JGastroenterol，2005，11（21）：3197-3203.

［12］ 朱佳蕾，邓夏珩，高 丽，等.白藜芦醇通过核因子-κB信号通路抑制脑缺血基质金属蛋白酶功能上调［J］.中国老年学杂志，2013，3（33）：1073-1075.

［13］ Zhao Q，Liu ZD，Xue Y，etal.Ds-echinoside A，a new triterpene g1ycoside derived from sea cucumber，exhibits antimetastatic activity via the inhibition of NF-κB-dependentMMP-9 and VEGF expressions［J］.J ZheJiang Univ Sci B，2011，12（7）：534-544.

［14］ Nagase H，Woessner J F Jr.Matrix meta11oproteinases［J］.J Biol Chem，1999，274（31）：491-494.

*通信作者：周晓慧（1957—），女，硕士，教授，从事心血管药理学的研究。Te1：18931416039

作者简介：徐 倩（1984—），女，硕士，实验师，从事心血管药理学的研究。Te1：18932896530，E-mai1：sdwssnow@163.com

基金项目：河北省自然科学基金（C2011406009）

收稿日期：2015-12-18

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.039

中图分类号：I966

文献标志码：B

文章编号：1001-1528（2016）03-0662-03