补中益气丸对溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜mRNA表达的影响

罗 书， 李燕舞， 巫燕莉， 杜 群（广州中医药大学脾胃研究所，广东广州510405）



补中益气丸对溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜mRNA表达的影响

罗 书， 李燕舞*， 巫燕莉， 杜 群
（广州中医药大学脾胃研究所，广东广州510405）

摘要：目的 研究补中益气丸（黄芪、白术、陈皮等）对溃疡性结肠炎（UC）小鼠结肠黏膜NOD样受体蛋白3（Nlrp3）、凋亡相关的斑点样蛋白（Asc）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（caspase-I）m INA表达的影响，评估其对UC的预防作用。方法 将60只C57BL/6小鼠随机分为空白组，模型组，柳氮磺砒啶（SASP）对照组，补中益气丸高、中、低剂量组，每组10只。除正常组外，其余各组予3%葡聚糖硫酸钠（DSS）造模；正常组、模型组每日给予蒸馏水0.01 mL/g；阳性对照组每日给予柳氮磺砒啶1.33 g/kg；补中益气丸高、中、低剂量组每日分别给予补中益气丸12、6、3 g/kg，连续给药7 d后，提取结肠样本，观察小鼠结肠病理变化，实时荧光定量-聚合酶链式反应检测结肠粘膜Nlrp3、Asc、caspase-I的m INA表达水平。结果 模型组小鼠病理检测显示结肠上皮糜烂、出血、多病灶浅溃疡、大量炎细胞浸润，而给药组均不同程度地改善上述症状。与空白组、柳氮磺砒啶对照组比较，模型组Nlrp3表达显著增高（P＜0.05）；与补中益气丸各组比较，没有明显差异（P＞0.05）；与其它各组比较，模型组Asc、caspase-I m INA表达均显著增高（P＜0.05）。结论 补中益气丸对DSS诱导小鼠UC有一定预防作用，其虽未能抑制Nlrp3表达，却能明显抑制Asc、caspase-I表达，提示其对小鼠UC预防作用机制可能与抑制结肠黏膜Asc、caspase-I表达，阻断Nlrp3炎性体装配有关。

关键词：溃疡性结肠炎；补中益气丸；NOD样受体蛋白3；凋亡相关的斑点样蛋白；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1

KEY W 0RDS：u1cerative co1itis；Buzhong Yiqi Pi11s；NOD-1ike receptor protein 3（Nlrp3）；apoptosis-associated speck-1ike proteincontaining CAID（Asc）；cysteiny1aspartate specific proteinase-1（caspase-I）

炎症性肠病是一组病因和发病机制不明的慢性肠道非特异性疾病，其病变位于大肠，呈连续性弥漫分布，多数累及直肠和乙状结肠。溃疡性结肠炎（UC）是炎症性肠病的一种，其典型临床症状包括黏液脓血便和腹痛腹泻［1］。由于本病病因及发病机制尚未明确，且难治愈，易复发，已被世界卫生组织列为现代难治病［2］。葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠UC模型是目前应用最为广泛的模型之一，具有造模简便、价格便宜、成功率较高等特点，且临床表现、病变部位、病理学表现与人类UC极其相似，因此在相关研究中占有重要地位［3］。

NLIP3炎性小体由NLIP3（NOD样受体蛋白3）、ASC（凋亡相关的斑点样蛋白）和caspase-1（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1）组成。NLIP3炎性小体在维持肠道内环境稳态中起重要作用，其激活是一把双刃剑。一方面，肠腔病原体及其代谢产物等不良因素可以激活NLIP3炎性体，激发肠道固有免疫发挥屏障防御作用；另一方面，炎性体的激活可导致白细胞介素-1（IL-1）家族炎性因子分泌过多，加重肠黏膜炎症反应造成肠道损伤［4］。

补中益气丸由黄芪、白术、陈皮、升麻、柴胡、人参、甘草、当归、生姜、大枣组成，具有补中益气，升阳举陷之功效。李日光［5］以补中益气丸联合柳氮磺吡啶（SASP）治疗40例UC患者，总有效率达90%，疗效显著，证明补中益气丸对UC具有确定的疗效。本实验通过DSS诱导的小鼠UC模型，以NLIP3炎性小体为切入点，探讨补中益气丸对UC的预防作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6小鼠，雌性，体质量

18～22 g，动物合格证编号44007200014518，由广东省实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 DSS（分子量为36 000～50 000）由广州市红烁林生物科技有限公司提供；SASP由上海三维制药有限公司生产，批号20130915；补中益气丸由北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂生产，批号Z11020244；INAiso P1us（货号9108）、5×PrimeScript IT Master Mix（货号I I 036A）、SYBI Premix Ex Taq II（货号G0668）均由宝生物工程（大连）有限公司提供。

1.3 仪器 3K30/V低温高速离心机（美国Sigma公司）；D-8721 PCI仪（日本Takara公司）；NanoDrop 2000分光光度计（美国Thermo公司）；PTC-220荧光定量PCI仪（美国Bio-Iad公司）。

1.4 分组与造模 将60只C57BL/6小鼠随机分为空白组，模型组，阳性药物对照组，补中益气丸高、中、低剂量组，每组10只。除空白组外，其余各组予3% DSS水溶液代替饮用水1周，隔天更换新鲜DSS水溶液。

1.5 给药 研磨SASP片和补中益气丸，制成溶液，于造模同时给药，连续7 d。空白组和模型组每日给予蒸馏水0.01 mL/g；阳性药物对照组每日给予SASP 1.33 g/kg，按成人等效剂量换算；补中益气丸高、中、低剂量组每日分别给予补中益气丸12、6、3 g/kg，分别按成人有效剂量40、20、10倍换算。

1.6 取样 麻醉处死小鼠，剪取肛门至回盲部的整段结肠，测量长度，沿肠系膜边缘纵向剖开，清理内容物，用预冷生理盐水清洗，滤纸除去多余水分，称取结肠总质量，计算单位结肠质量（单位结肠质量＝结肠总质量/结肠长度）。

1.7 病理组织观察 截取中段结肠0.5 cm，4%甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，厚度为5 μm，进行HE染色，光镜下观察黏膜完整性、黏膜内炎症细胞的浸润及肠腺体改变。

1.8 结肠黏膜Nlrp3、Asc、caspase-I的m INA表达

1.8.1 提取总INA 取结肠样本100 mg，加入1 mL INAiso P1us，冰上充分研磨，室温静置5 min，12 000×g，4℃，离心5 min；取上清于新离心管中，加入200 μL氯仿，震荡混匀，室温静置5 min，12 000×g，4℃，离心15 min；取上清于新离心管中，加入同体积异丙醇，充分混匀，室温静置10 min，12 000×g，4℃，离心10 min；弃上清保留沉淀，加入1 mL 75%酒精，反复吹打，12 000×g，4℃，离心5min；弃上清，保留沉淀，待酒精挥发后，加入50 μL去离子水，溶解沉淀，-20℃保存。

1.8.2 引物合成 查阅文献，确定Nlrp3、Asc、caspase-I的引物，以Gapdh为内参，引物核苷酸序列见表1，由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 qPCR Primer sequences

1.8.3 逆转录反应 参照5×PrimeScript IT Master Mix逆转录试剂盒说明操作。逆转录反应条件为37℃15 min，85℃5 s，4℃终止。

1.8.4 qPCI反应 参照SYBI Premix Ex TaqⅡ荧光物质试剂盒说明操作。反应条件为95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，39个循环后72℃延伸7 min。

1.8.5 qPCI结果 采用2-△△Ct法，以模型组小鼠结肠m INA表达为参照，对结果行相对定量分析。

1.9 统计学处理 实验数据采用SPSS 17.0软件分析，数据以±s进行表示，组间数据比较采用独立样本t检验和单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠结肠长度及结肠质量结果 由表2可见，与空白组比较，模型组结肠长度缩短（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组、补中益气丸低剂量组结肠长度增长（P＜0.05），补中益气丸高、中剂量组结肠长度无明显差异（P＞0.05）。与空白组比较，模型组结肠质量增加（P＜0.05）；与模型组比较，用药组结肠质量无明显差异（P＞0.05），但有下降的趋势。

表2 结肠长度和质量（±s，n＝8）Tab.2 Lengths and Weights of colon（±s，n＝8）

表2 结肠长度和质量（±s，n＝8）Tab.2 Lengths and Weights of colon（±s，n＝8）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别　　结肠长度/cm单位结肠质量/（g·cm-1）空白组6.46±0.32　0.022±0.003模型组　4.88±0.56*　0.031±0.003*阳性对照组　6.00±0.35△　0.029±0.003补中益气丸高剂量组　5.06±0.56　0.030±0.004补中益气丸中剂量组　5.58±0.18　0.029±0.002补中益气丸低剂量组　6.08±0.41△0.029±0.002

2.2 病理形态学观察结果 HE染色显示（图1），空白组小鼠结肠未见明显病理变化；模型组小鼠结肠腺体全部消失，黏膜水肿，黏膜下大量炎细胞浸润；阳性对照组及补中益气丸高、中、低剂量组均见腺体大部分消失，黏膜不同程度的水肿，黏膜下大量炎细胞浸润。

2.3 结肠粘膜Nlrp3、Asc、caspase-I的m INA表达结果 由表3可见，与空白组比较，模型组Nlrp3表达显著增高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组表达减少（P＜0.05），补中益气丸高、中、低剂量组表达均无明显差异（P＞0.05）。与空白组比较，模型组Asc表达显著增高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组、补中益气丸组表达显著减少（P＜0.05）。与空白组比较，模型组caspase-I表达显著增高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和补中益气丸高、中剂量组表达显著减少（P＜0.05），但补中益气丸低剂量组无明显差异（P＞0.05）。

3 讨论

UC是原因不明的累及全肠的非特异性炎症，以腹泻、黏液血便、腹痛、里急后重为主要特征，并伴有乏力、消瘦、饮食欲下降等全身症状。属于中医“痢疾”、“滞下”、“肠风”、“泄泻”等范畴。中医认为，该病病机是本虚标实，虚实夹杂。本虚责之于脾，因此，防治UC当以益气健脾入手。史柯［6］以益气健脾法治疗41例UC患者，总有效率达92.7%，体现了益气健脾法在UC防治上的作用。补中益气丸是健脾益气的经典方，由黄芪、白术、陈皮、升麻、柴胡、人参、甘草、当归、生姜、大枣组成，临床将之用于治疗UC取得较好疗效。

图1 补中益气丸对UC模型小鼠结肠组织病理组织学的影响（HE，×100）Fig.1 Effect of BZYQ colon histopathology in m iceWith ulcerative colitis（HE，×100）

表3 结肠黏膜Nlrp3，Asc，caspase-1的mRNA表达量（±s，n＝8）Tab.3 Nlrp3，Asc and caspase-1 m RNA expressions in colonic mucosal（±s，n＝8）

表3 结肠黏膜Nlrp3，Asc，caspase-1的mRNA表达量（±s，n＝8）Tab.3 Nlrp3，Asc and caspase-1 m RNA expressions in colonic mucosal（±s，n＝8）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别Nlrp3　Asc　caspase-I空白组0.177±0.029 0.246±0.035　 0.234±0.028模型组　0.943±0.079*0.967±0.090*0.984±0.124*阳性对照组　0.456±0.049△0.369±0.105△0.439±0.061△补中益气丸高剂量组　0.804±0.077 0.378±0.086△0.567±0.069△补中益气丸中剂量组　0.801±0.089 0.422±0.064△0.447±0.063△补中益气丸低剂量组　0.868±0.131 0.618±0.090△0.863±0.102

DSS是由蔗糖合成的一种硫酸多糖体，能诱发UC。王显飞等［7］通过实验证实单个循环饮用3% DSS可诱导C57BL/6小鼠发生与人类临床和病理表现相似的结肠炎。该模型制作简便、经济，重复性好，可用于UC发病机制、病理变化和药物疗效评估的研究，应用广泛［8］。

NLIP3是NOD样受体家族的主要成员，近年研究表明其参与维持肠道环境的稳定，并与炎症性肠病的发生发展息息相关［9］。NLIP3炎性小体由NLIP3、ASC和caspase-I组成。NLIP3的激活可致其热蛋白结构域（pyrindomain，PYD）与ASC 的PYD连接，致ASC的胱天蛋白酶招募结构域（caspase recruitment domain，CAID）与caspase-I 的CAID结合，完成NLIP3炎性体的装配从而活化caspase-I进而参与肠道免疫反应［10］。Bauer等［11-12］研究表明，DSS可通过NLIP3炎性体的装配，激活caspase-I从而诱导结肠炎症损伤，NLIP3基因敲除以及对caspase-I药理抑制可有效减轻DSS诱导小鼠结肠症状。Wu等［13］研究表明，抑制NLIP3炎性体的激活可能是治疗炎症性肠病（inf1ammatory bowe1 disease，IBD）的途径。但Zaki等［14］却认为，肠道NLIP3基因缺陷可以导致肠粘膜屏障通透性增强，诱导有害免疫反应，进而加重IBD过程中肠粘膜损伤。

本研究采用3% DSS诱导小鼠UC，同时给予补中益气丸高、中、低剂量和SASP进行预防干预。实验结果发现DSS饮水可诱导C57BL/6小鼠出现黏液血便、消瘦以及肠黏膜的急性炎症损伤，补中益气丸高、中、低剂量及SASP均能在不同程度上改善DSS模型组小鼠的结肠损伤程度及小鼠生存状态。针对NLIP3炎性体进一步研究显示，DSS诱导的结肠炎模型小鼠结肠黏膜Nlrp3、Asc、caspase-I的m INA表达均显著增高，提示炎性体的激活可能是DSS诱导肠黏膜损伤的直接因素。同时，益气健脾复方及临床常用抗炎药物SASP预防给药对NLIP3炎性体复合物的基因表达均有显著的抑制作用。其中补中益气丸能显著抑制Asc和caspase-I的m INA表达，SASP则对Nlrp3、Asc、caspase-I的表达均明显抑制。可见，预防给予抗炎或益气健脾复方，可在不同程度加强肠黏膜的抗损伤能力，其作用机制可能与抑制Asc的表达，阻断Nlrp3炎性体的装配，阻止caspase-I活化有关。研究为临床UC预防治疗及缓解期用药提供了实验依据。

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Effect of Buzhong Yiqi Pills on m RNA expression in colonic mucosal of m ice With ulcerative colitis

LUO Shu， LIYan-wu*， WU Yan-1i， DU Qun

（Institute of Spleen and Stomach，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 5IO4O5，China）

ABSTRACT：AIM To exp1ore the effects of Buzhong Yiqi Pi11s（Astragalusmembransaceus，Atractylodesmacrocephala，Citrus reticulatea，etc.）on Nlrp3，Asc and caspase-I expressions in co1onicmucosa1ofmice with u1cerative co1itis and to eva1uate its preventive effects against u1cerative co1itis.METH0 DS Sixty C57BL/6 micewere random1y divided into the norma1 group，mode1 group，positive contro1 group，Buzhong Yiqi Pi11s high，midd1e and 1ow dose groups，with ten mice in each group.Mice in themode1group，positive contro1group，Buzhong Yiqi Pi11s high，midd1e and 1ow dose groupswere treated with 3% DSS.Mice in the positive contro1group were treated with 1.33 g/kg SASP，mice in the Buzhong Yiqi Pi11s high，midd1e and 1ow dose groups were treated with 12 g/kg，6 g/kg and 3 g/kg Buzhong Yiqi Pi11s，respective1y，and mice in the norma1group and mode1group were treated with 0.01 mL/g disti11ed water.A11 the groupswere treated for seven consecutive days.After seven days，the patho1ogica1 changes in co1onic mucosa1ofmice were observed.Meanwhi1e，m INA expressions of Nlrp3，Ascbook=486,ebook=20and caspase-I were detected by IT-qPCI ana1ysis.RESULTS Compared with the norma1 group，the mode1 group’s patho1ogica1examination showed co1on epithe1ia1 erosion，b1eeding，mu1tifoca1 u1cers and numerous inf1ammation ce11s infi1trating.However，the symptomswere improved in other groups.The expression of Nlrp3 m INA in themode1group was obvious1y higher than that in the norma1group and positive contro1group（P＜0.05），which was not different from a11 the Buzhong Yiqi Pi11s groups（P＞0.05）.The expressions of Asc and caspase-I m INA in the mode1group were obvious1y higher than those in another groups（P＜0.05）.C0NCLUSI0N Buzhong Yiqi Pi11s show certain preventive effects against DSS-induced u1cerative in mice.They do not inhibit the expression of Nlrp3，but inhibit the expressions of Asc and caspase-I.Themechanism of preventing the u1cerative co1itis in micemay be re1ated to the inhibition of Asc m INA and caspase-I m INA expressions to b1ock the formation of Nlrp3 inf1ammasome.

*通信作者：李燕舞（1976—），女，博士，副研究员，从事胃肠黏膜损伤及中药复方的防治机制研究。Te1：（020）36585555，E-mai1：1yw_ 7614@126.com

作者简介：罗 书（1988—），男，硕士生，从事中西医结合基础研究。Te1：18819324404，E-mai1：1uoshu088323@163.com

基金项目：国家自然科学基金项目（81202627）；华南中医药协同创新中心-中医药防治脾胃病、脑病创新研究团队项目（A1-AFD01514A05）

收稿日期：2015-10-16

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.003

中图分类号：I285.5

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）03-0485-05