内质网应激致2型糖尿病缺血心肌易损性增强的机制研究

顾晨，李俊明



内质网应激致2型糖尿病缺血心肌易损性增强的机制研究

顾晨，李俊明

摘要

Mechanism of Increased Myocardial Ischemic Vulnerability in Mice Type 2 Diabetes Mellitus Induced by Endoplasmic Reticulum Stress

GU Chen, LI Jun-ming.
Three Gorges University People’s Hospital, Yichang (443002), Hubei, China
Corresponding Author: LI Jun-ming, Email: lijunming@medmail.com.cn

Abstract

Objective: To study the relationship between endoplasmic reticulum stress (ERS) and adiponectin; to explore the role of ERS for increasing myocardial ischemic vulnerability in type 2 diabetes mellitus (DM) mice.

Methods: Type 2 DM model was established by high fat diet with streptozotocin (STZ) injection. A total of 35 C57BL/6J male type 2 DM mice were divided into 4 groups: ①Control group, n=5. ②Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) group, ③Thapsigargin (TG) group and ④Normal saline group. The mice in Groups ②, ③, ④ were fed by high fat and high glucose diet by injecting streptozotocin (STZ), in the last 3 weeks and respectively received intraperitoneal injections of TUDCA (250 mg/kg), thapsigargin (TG) (300 μg/kg) and normal saline twice a day, n=10 in each group. Then myocardial infarction (MI) model was established in 5 mice from each group. 72 hours later, the MI ranges were measured, serum levels of adiponectin were detected, mRNA expressions of adiponectin and CHOP in myocardial tissue were examined.

Results: The MI range in TUDCA group (21.47 ± 2.85) % and in Normal saline group (39.92 ± 4.28) % were both lower than TG group (66.56 ± 8.15) %, both P<0.01. Before MI occurrence, serum levels of adiponectin in TUDCA group (79.25 ± 6.40) pg/ml and in Normal saline group (70.23 ± 4.15) pg/ml were both higher than TG group (62.64 ± 5.70) pg/ml,both P<0.01; serum levels of adiponectin in each group were higher than they were 72 h after MI. In each group, the mRNA expression and protein content of adiponectin in myocardial tissue were constant to serum adiponectin; while the mRNA expression and protein content of CHOP was opposite to serum adiponectin.

Conclusion: ESR could increase myocardial vulnerability in type 2 DM mice which might be related to down-regulating adiponectin expression.

Key words Diabetes mellitus, Type 2; Endoplasmic reticulum; stress; Myocarial ischemia

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:91.)

高血糖和高脂血症不仅导致血管损伤从而诱发缺血性心脏病，且直接损害心肌细胞，导致在缺血再灌注后更广泛的心肌梗死和更严重的心力衰竭[1-5]。脂联素是一种主要由脂肪组织合成、分泌的脂肪细胞因子，具有调节代谢、抗炎及心血管保护作用，血清脂联素水平降低能导致心肌纤维化的发生、发展[6]。多项研究表明糖尿患者血浆脂联素水平降低可能是导致缺血性心脏病的关键因素[7，8]。脂联素通过多个信号通路发挥其心血管的保护作用[9]。因此，上调脂联素水平能够减轻糖尿病心肌缺血损伤，但对于脂联素的上游调节机制仍不是很清楚。缺氧等多种因素导致未折叠或错误折叠蛋白质在内质网腔蓄积，致使内质网功能发生改变，统称内质网应激（ERS）[10-12]。而牛磺脱氧胆酸（TUDCA）是一种缓解ERS的化学分子伴侣，能减轻ERS状态下的巨噬细胞的脂质蓄积[13]，毒胡萝卜内酯是一种通过抑制内质网Ca2+-ATP酶导致ERS的化学抑制剂。凋亡相关蛋白C/EBP 同源蛋白（CHOP）是ERS的一种特征性标志分子。心肌缺血/再灌注损伤（IRI）时，ERS信号通路被激活，分子伴侣以及促凋亡信号分子表达增加[14-16]。TUDCA能降低CHOP的表达即缓解ERS，明显缓解毒胡萝卜内酯所引起的脂联素水平的下调[17]。

基于上述研究结果，我们提出假设：2 型糖尿病心肌缺血可以引发ERS，ERS加重可下调血浆与心肌脂联素水平，进而导致缺血心肌易损性增加。

1　材料与方法

实验动物及分组：SPF级6周龄健康C57BL/6J雄性小鼠35只，购于武 汉 大 学 动 物 实 验 中 心。小鼠在无特定病原体的环境中喂养，给予充足饮水，室温在22～24℃，光照时间（上午8:00起至下午8:00）共12小时照明、12小时黑暗的灯光明暗周期。采用高糖高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）诱导小鼠发生高血糖后，小鼠称重后按随机数字表法将糖尿病小鼠分为对照组（n=5）、生理盐水组（n=10）、TUDCA组（n=10）和毒胡萝卜内酯组（n=10）。在高糖高脂饲料喂养的最后3周，TUDCA组、毒胡萝卜内酯组和生理盐水组分别经腹腔注射给予 TUDCA （250 mg/kg）、毒胡萝卜内酯（300 μg/kg）和等量生理盐水，每日两次（上午8:00和下午8:00），连续给药3周。

主要实验材料和试剂：高糖高脂饲料购于武汉春龙实验动物饲料机械经营部；STZ购于北京博爱港商贸中心；便 携 式 稳 步 系 列 血 糖 仪 及血糖试纸购于强 生（上海）医 疗 器 材 有 限 公 司 ；戊巴比妥钠购于德国Merck公司；TUDCA购于美国Calbiochem公司；毒胡萝卜内酯购于美国 ALEXIS Biochemicals公司；小鼠脂联素酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购于上海伟进生物科技有限公司；One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit Ⅱ购于大连宝生物工程有限公司；引物购于上海生工生物工程有限公司；脂联素抗体购于美国ABcom公司；CHOP抗体购于美国Proteintech公司。

2 型糖尿病动物模型：采用高糖高脂饮食联合STZ诱导小鼠发生高血糖。先给予35只小鼠标准的啮齿类动物饲料适应性喂养1周，1周后给予脂肪含量为60%的高糖高脂饲料喂养，于第3周末腹腔注射STZ 85 mg/kg（连续注射两天，1 次/天），给药后继续给予脂肪含量为60%的高糖高脂饲料喂养，高糖高脂饲料喂养共3个月。应用便携式稳步系列血糖仪检测空腹血糖并记录体重[18，19]时间点为：给药前及第4、5、7个周末，最后为第3个月末。血 糖 ≥16.7 mmol/L 认 为糖 尿 病 模 型 建 立 成 功。

小鼠在体心肌梗死模型：糖尿病模型建立成功后，除对照组外，从其他各组的10只小鼠中随机选5只进行心肌梗死手术。用2%戊 巴比妥钠溶液经腹腔给药麻醉小鼠 ，剪去小鼠胸前毛，快速开胸，开口处于小鼠左侧第4肋间，迅速挤出心脏，用6-0丝 线 在 小 鼠 冠 状动脉 左 前 降 支 距 根 部2～3 mm处打一死结造成心肌缺血，迅速关闭小鼠胸腔。

标本的收集与处理：（1）血清的收集与处理：心肌梗死72 h后，用2%戊巴比妥钠经腹腔注射将小鼠麻醉后，将小鼠头朝下倒置片刻使其头部充血，再用无齿眼科镊子摘取小鼠眼球取血，将血至于1.5 ml离心管中室温静置30 min后，再放于4℃冰箱中静置30 min后，离心15 min（8000 g），取上清后，分组标记后，-80℃冰箱保存，后用ELISA法检 测血 清 脂 联 素 含 量 。（2）心肌的收集与处理：心肌梗死72 h后，用2%戊 巴 比 妥 钠 将小鼠麻醉后，打开小鼠胸腔，分离心脏，剥离心脏，用 冰 生 理 盐水 将 心 腔 内 血 液 冲 洗 干 净 ，分组标记后，放于-80℃冰箱保存后，用三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法检测心肌梗死范围。免 疫 组 织 化 学 法 检测心肌组织中脂联素以及CHOP，实时定量荧光聚合酶链式反应（Real time-PCR）方法检测心肌组织中脂联素以及CHOP的表达水平。

心肌梗死面积测定：小鼠缺血72 h后，取心肌用于检测心肌梗死范围。用2%戊巴比妥钠将小鼠麻醉后，打开小鼠胸腔，分离心脏，剥离心脏，-20℃冻存1 h后，将冰冻后的心脏做垂直左心室长轴连续环切，每片厚 1～1.5 mm，将心肌组织置于 1% TTC液中 37℃水浴 15 min（避光、每1 min翻面1次），取出切片，用滤纸吸干液体后，在10%福尔马林中固定20 min后取出，用滤纸吸干液体后照相，正常区域为红色，梗死区为白色。用Image J软件分析照片。以梗死心肌（白色区）与全左心室心肌（红色区与白色区）的比值表示心肌梗死面积。

血清脂联素检测：使用ELISA法检测血清脂联素浓度[20]，按照试剂盒说明书步骤操作。得到数据后，以标准品的浓度为横坐标，光密度（OD）值为纵坐标，绘制标准曲线；根据OD值查找各自对应的浓度。

免疫组织化学法检测心肌组织中脂联素以及CHOP含量：用显微镜观察并拍照。应用Image-Pro Plus 6.0软件对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度（IOD）值。阳性表达越强、IOD值越大，含量也越大。每组所有照片的平均IOD值代表该组的IOD值用均数±标准差表示。

Real time-PCR 方法检测心肌组织中脂联素mRNA以及CHOP mRNA表达水平：先根据Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，再根据One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit Ⅱ的说明配制反应体系进行Real Time One Step RT-PCR反应，反应完毕后，将样本的扩增曲线、融解曲线、CT值导入Word文档中，待数据分析。

引物序列如下：CHOP：上游引物：5'-AAGTCAGCCCGAGAAGAACC-3'，下游引物：5'-TGTGAAGGTCCAACTCAAGA-3'；脂联素：上游引物：5'- CCGCTTATGTGTATCGCTCCG -3'，下游引物：5'- TGGTCGTAGGTGAAGAGAAAG-3'；β-肌动蛋白：上游引物：5'- ATATCGCTGCGCTGGTCGGC-3'，下游引物：5'- AGGATGGCGTGAGGGAGATC-3'。

统计学处理：采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示。所有数据先进行正态分布检验、方差齐性检验，不同组间均采用One-way ANOVA单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

4组小鼠心肌梗死面积比较：TUDCA组和生理盐水组小鼠心肌梗死面积分别为（21.47±2.85）%和（39.92±4.28）%，均小于毒胡萝卜内酯组[（66.56±8.15）%，P<0.01]。

ELISA法检测血清脂联素浓度（表1）：TUDCA组与生理盐水组血清脂联素浓度均高于毒胡萝卜内酯组（P<0.01），各组心肌梗死前血清脂联素浓度较心肌梗死72 h时水平高（P<0.01）。

表1　4组小鼠血清 脂 联 素 浓 度比较（pg/ml，?±s）

4组小鼠心肌组织中脂联素及CHOP含量比较（表2）：TUDCA组和生理盐水 组小鼠心肌组织中脂联素含量均高于毒胡萝卜内酯组（P<0.01），各组小鼠心肌梗死前心肌组织中脂联素含量均高于心肌梗死72 h（P<0.01）。TUDCA组和生理盐水 组小鼠心肌组织中CHOP含量低于毒胡萝卜内酯组（P<0.01），各组小鼠心肌梗死前心肌组织中CHOP含量均低于心肌梗死72 h（P<0.01）。

表2　4组小鼠心肌组织中脂联素及CHOP含量比较

4组小鼠心肌组织中脂联素mRNA及CHOP mRNA表达水平比较（表3）：生理盐水组和TUDCA组小鼠的心肌组织中脂联素mRNA表达水平均高于毒胡萝卜内酯组（P<0.01），各组小鼠心肌梗死前心肌组织中脂联素mRNA表达水平均高于心肌梗死72 h（P<0.01）。生理盐水组和TUDCA组小鼠心肌组织中CHOP mRNA表达水平低于毒胡萝卜内酯组（P<0.01），各组小鼠心肌梗死前心肌组织中CHOP mRNA表达水平均低于心肌梗死72 h时水平（P<0.01）。

表3　4组小鼠心肌组织中脂 联 素 mRNA及CHOP mRNA表达水平比较

3　讨论

多项研究发现，在糖尿病发生发展过程中，心肌组织结构和（或）功能发生改变[21]，对缺血损伤敏感性增加，即在糖尿病状态下，心肌组织本身对缺血具有高敏感性，容易发生缺血性损伤。但是这种易感性增高的具体机制并不十分明确。

多种因素如低氧、高血糖、化学毒物等能诱发ERS[10-12]，而诱发因素的持续存在能导致ERS持续存在并逐渐加重。由于本研究中实验组均为糖尿病组，故而所指ERS为持续性ERS。ERS 诱导细胞凋亡主要通过三种途径: CHOP 途径、细胞凋亡信号调节激酶1-c-Jun N-末端激酶（ASK1-JND）途径和半胱氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）途径[22，23]。本研究通过测量CHOP的表达来衡量ERS，发现各组心肌梗死前心肌组织中CHOP的表达水平及含量均低于心肌梗死72 h时水平，提示ERS与2型糖尿病心肌缺血损伤有相关性。此外， TUDCA组小鼠心肌梗死72 h心肌组织中CHOP的表达水平以及含量均低于毒胡萝卜内酯组，表明心肌梗死72 h TUDCA组小鼠ERS的程度低于毒胡萝卜内酯组。同时心肌梗死72 h TUDCA组小鼠心肌梗死面积小于毒胡萝卜内酯组，提示缓解ERS能减轻缺血心肌的受损程度。而抑制ERS和炎症，能阻止2型糖尿病小鼠缺血损伤诱导的血管病变[24]。综合这些结果，我们可以得出ERS与2型糖尿病缺血心肌受损程度正相关。

临床研究发现，血浆脂联素水平与心肌梗死发病率呈明显负相关，2 型糖尿患者血液中脂联素水平降低不仅可能参与糖尿病所致的缺血性心脏病的发生，也可能是糖尿病患者缺血性心脏病发作后心肌损伤程度加重的重要原因。在心肌细胞中，脂联素通过磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）通路抗凋亡和环氧合酶2-前列腺素E2-受体EP4（COX2-PGE2-EP4）通路抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的产生，从而保护缺血再灌注心脏。也可以通过抑制诱导型一氧化氮合酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的表达进而抑制氧化/硝化联合应激，直接保护心肌[8]。

在心脏损伤的研究中，临床资料显示血浆脂联素浓度持续降低可以显著增加糖尿病患者急性心肌梗死的发生率，同时，脂联素的血浆水平与心肌梗死面积和左心室射血分数呈高度负相关[25]。脂联素基因敲除小鼠心肌缺血/再灌注损伤明显加重，而补充外源重组脂联素具有明确的心脏保护作用。越来越多的数据显示，血浆脂联素水平较低的人群，其缺血性心脏病发病率较高，提示脂联素水平降低可能是导致冠状动脉损伤和心肌缺血的重要原因。本研究结果与早期发现一致。

在3T3-L1脂肪细胞中，诱导ERS有效促进自噬相关的脂联素降解，相反，抑制ERS后3T3-L1脂肪细胞中脂联素水平增加，缓解了小鼠体内高脂饮食诱导的脂联素水平下调[26]；此外，ERS在糖尿病、肥胖引起的脂联素下调中起到关键作用：ERS持续加重的过程中，脂联素多聚体的合成及分泌减少，提示ERS是细胞中脂联素水平下调的原因[27]。本实验结果显示，ERS加重能下调脂联素的水平，而缓解ERS可以减轻脂联素水平的下调，ERS与脂联素的水平负相关，ERS可能通过下调脂联素的水平，增加了缺血心肌的易损性。但ERS下调脂联素的机制有待进一步研究。

另一方面，应用脂联素受体激动剂或将上调脂联素受体水平作为治疗靶点可保护缺血心脏；而脂联素信号受损则可加重缺血心肌损伤。但脂联素基因敲除或补充外源重组脂联素对ERS下调脂联素水平有何影响；给予加重ERS的药物后补充外源重组脂联素，2型糖尿病缺血心肌受损程度能否缓解，均有待进一步研究。

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（编辑：许菁）

难忘病例

收稿日期：（2015-06-30）

中图分类号：R54

文献标识码：A

文章编号：1000-3614（2016）01-0091-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.01.020

作者简介：顾晨 住院医师 硕士 研究方向为心血管疾病分子机制 Email: 382197751@qq.com 通讯作者：李俊明 Email: lijunming@medmail.com.cn

基金项目：湖北省教育厅自然科学研究项目（D20121309）；国家自然科学基金面上项目（81270280）

目的：研究内质网应激（ERS）与脂联素的相关性及其在2型糖尿病缺血心肌易损性增强中的作用。

方法：35只C57BL/6J 雄性小鼠采用高糖高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）诱导2型糖尿病模型，按随机数字表法将糖尿病小鼠分为对照组（n=5）、牛磺脱氧胆酸（TUDCA）组（n=10）、毒胡萝卜内酯组（n=10）和生理盐水组（n=10）。对照组不做任何处理，其他三组在高糖高脂饲料喂养的最后3周，分别用TUDCA（250 mg/kg）、毒胡萝卜内酯（300 μg/kg）和等量生理盐水腹腔注射给药，2次/天，连续给药3周后，TUDCA组、毒胡萝卜内酯组和生理盐水组各随机选取5只建立小鼠在体心肌梗死模型。心肌梗死72 h后，检测心肌梗死面积、血清脂联素含量、心肌组织中脂联素和凋亡相关蛋白C/EBP 同源蛋白（CHOP）的含量及脂联素和CHOP mRNA表达水平。

结果：TUDCA组及生理盐水组小鼠心肌梗死面积分别为（21.47±2.85）%和（39.92±4.28）%，均小于毒胡萝卜内酯组[（66.56±8.15）%，P均<0.01]。心肌梗死前，TUDCA组[（79.25±6.40） pg/ml]和生理盐水组[（70.23±4.15）pg/ml]血清脂联素浓度均高于毒胡萝卜内酯组[（62.64±5.70）pg/ml，P均<0.01]，各组小鼠心肌梗死前血清脂联素浓度均高于心肌梗死72 h时浓度；各组小鼠心肌组织中脂联素含量及mRNA表达水平检测结果与血清脂联素检测结果一致，而CHOP含量及mRNA表达水平检测结果则与之相反。

结论：2 型糖尿病导致的心肌缺血损伤加重与ERS相关；ERS可能在2型糖尿病心肌易损性增强中起着重要作用，ERS加重后通过下调脂联素水平，增加了2型糖尿病心肌易损性。关键词 糖尿病，2 型；内质网；心肌缺血

作者单位：443002 湖北省宜昌市，三峡大学人民医院（宜昌市第一人民医院）