滇黄芩总黄酮不同提取方法的比较分析

刘海鸥　虎春艳　普春霞　刘晓玲　林玉萍　赵声兰

云南中医学院中药学院，昆明　650500



药物研究

滇黄芩总黄酮不同提取方法的比较分析

刘海鸥虎春艳普春霞刘晓玲林玉萍*赵声兰

云南中医学院中药学院，昆明650500

【摘要】目的: 研究不同提取方法对滇黄芩总黄酮提取率的影响。方法:以滇黄芩总黄酮得率、干膏得率为指标，对煎煮法、乙醇回流提取法、纤维素酶-磷酸缓冲水溶液提取法、乙醇超声提取法、纤维素酶-乙醇超声提取法进行研究分析。结果:考察五种提取方法对考察指标的影响，计算综合评价指标Y值，Y值的大小顺序为纤维素酶-乙醇超声提取法>乙醇超声提取法>煎煮法>乙醇回流提取法>纤维素酶-磷酸缓冲水溶液提取法。结论:滇黄芩总黄酮的提取方法以纤维素酶-乙醇超声提取法为佳。

【关键词】滇黄芩；总黄酮；提取方法；比较分析

滇黄芩(ScutellariaamoenaC．H．W right)是云南道地中药材，地方本草《滇南本草》(明朝)记其“味苦，性寒，上行泻肺火，下降泻膀胱火”。滇黄芩为多年生草本，生于向阳坡草地、石隙或杂草丛中[1]。

滇黄芩是我国西南地区药用黄芩的主流品种，具有较高的利用价值。现代研究表明黄芩主要含有黄酮类成分及挥发油类、萜类、甾醇类等成分[2]，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、调节脂代谢、抗肿瘤、保护心血管系统等作用[3-7]。滇黄芩与黄芩相似，主要含有黄酮类化合物，目前对黄酮类化合物的提取方法有水提、醇提、酶解等提取方法。据文献报道纤维素酶可以提高药材有效成分的溶出率[8]，赵洪等研究发现乙醇和纤维素酶在提取总黄酮类成分时具有协同作用[9]。高文秀等[10]研究表明超声-酶解法在提取总黄酮成分时同样具有协同作用。为寻找具有较高总黄酮提取得率的提取方法，本文对不同的提取方法进行比较和分析，为滇黄芩的研究和开发奠定基础。

1材料与方法

1.1材料与仪器滇黄芩(ScutellariaamoenaC．H．W right)采自云南玉溪新平；黄芩苷标准品、纤维素酶(酶活力35U/mg)购自于中国药品生物制品检定所；所用试剂均为国产分析纯。

1.2主要仪器H.H.S11-4电热恒温水浴锅；超声仪(KUDOS)；电子天平(赛多瑞斯北京电子有限公司)；UV759S紫外-可见分光光度计(上海精科)；RE-2000A旋转蒸发仪(亚荣生化仪器厂)。

2实验方法

2.1样品溶液及干膏的制备

2.1.1煎煮法[11]精确称取3.0g 干燥的滇黄芩粉末，第1次加10倍量的沸水，100℃回流提取1.5h，趁热抽滤，滤渣再加8倍量的水100℃回流提取1h，趁热抽滤，合并两次滤液，冷却至室温，加蒸馏水定容至100ml，平行试验三次 ，测278nm处的吸光值。

2.1.2纤维素酶-磷酸缓冲水溶液提取法[12]精确称取3.0g 干燥的滇黄芩粉末，加入纤维素酶-磷酸缓冲水溶液(pH=4.8)60ml，煮沸3min，待冷却至室温，加20U/g(干原料)纤维素酶1.7mg，50℃回流提取8h，趁热抽滤，滤液置于沸水浴中灭活酶3min，加蒸馏水定容至100ml，平行试验三次 ，测278nm处的吸光值。

2.1.3乙醇回流提取法[13]精确称取3.0g 干燥的滇黄芩粉末，第1次加8倍量的60%乙醇水溶液，80℃水浴回流提取2h，趁热抽滤，滤渣再加6倍量的60%乙醇水溶液，80℃水浴回流提取0.5h，趁热抽滤，合并两次滤液，冷却至室温，加蒸馏水定容至100ml，平行试验三次 ，测278nm处的吸光值。

2.1.4纤维素酶-乙醇提取法[14]精确称取3.0g 干燥的滇黄芩粉末，加入50 %乙醇45ml，煮沸3min，待冷却至室温，加50U/g(干原料)纤维素酶4.3mg，50℃回流提取6h，趁热抽滤，滤液置于沸水浴中灭活酶3min，回收乙醇，加蒸馏水定容至100ml，平行试验三次 ，测278nm处的吸光值。

2.1.5纤维素酶-乙醇超声提取法[15]精确称取3.0g 干燥的滇黄芩粉末，加入55%乙醇90ml，煮沸3min，待冷却至室温，加50U/g(干原料)纤维素酶4.3mg，50℃超声回流提取3h，趁热抽滤，滤液置于沸水浴中灭活酶3min，回收乙醇，加蒸馏水定容至100ml，平行试验三次 ，测278nm处的吸光值。

2.1.6干膏的制备精密量取上述各样品溶液各10ml，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，50℃鼓风干燥至恒重，置于干燥器中冷却30min，称重，计算干膏得率。

2.2标准品全波长扫描取黄芩苷标准品溶液在200~400nm紫外下扫描，分别在278nm 和315nm处有较大吸收度，278nm有最大吸收，即λmax=278nm。

2.3标准曲线的制备精密称取黄芩苷对照品7.1mg，置于 25ml的容量瓶中，用70%的乙醇水溶液定容至25ml，摇匀，分别量取 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml置于25ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度。采用紫外分光光度计测其在278nm的吸光度(A)。以吸光度对浓度(C)进行线性回归，得到回归方程A= 63.248C- 0.0108 (R2= 0.9998)。

2.4样品的处理和提取率的计算采集的样品经普春霞副教授鉴定为滇黄芩，清洗、干燥、粉碎过20目筛。测定方法参照标准曲线的制备流程，根据标准曲线测定总黄酮的含量，根据如下公式计算得率。

η= [(C×V)/m]×100%

式中浓度C为滤液中总黄酮的质量浓度，mg/ml，体积V为滤液体积，m为滇黄芩干质量，g。

2.5五种提取方法的综合评价

将五种提取方法的总黄酮的得率和干膏得率进行标准化处理。

3结果与分析

3.1滇黄芩五种不同提取方法的总黄酮得率滇黄芩五种不同提取方法对总黄酮得率的影响见表1。

表1　提取方法对提取率的影响

从表 1可以看出,纤维素酶-磷酸缓冲水溶液提取法的总黄酮提取得率最低，而纤维素酶-乙醇超声提取法的提取得率最高。由于滇黄芩中的主要成分是黄酮类化合物，黄酮类化合物易溶于乙醇难溶于水，则采用乙醇做溶剂的提取得率均高于水做溶剂的提取方法。植物细胞壁中有大量的纤维素，纤维素酶可以有效的破坏细胞壁，有利于成分的溶出。超声波同样能加速细胞壁的裂解，加速成分的溶出，提高效率，缩短时间，减少杂质。

3.2滇黄芩五种不同提取方法的干膏得率五种提取方法得到的滇黄芩总黄酮的干膏得率见表2。

表2　提取方法对干膏得率的影响

从表2可以看出煎煮法得到的干膏得率最高，但煎煮法得到的总黄酮的得率却不高，说明煎煮法杂质溶出率高，纯化较困难。纤维素酶-磷酸缓冲水溶液提取法得到的干膏得率和总黄酮的含量均较低，说明单纯的酶解法作用不明显。纤维素酶-乙醇提取法两个指标相对于纤维素酶-磷酸缓冲水溶液提取法以及乙醇回流提取法均有所提高，说明纤维素酶和乙醇对滇黄芩总黄酮的提取存在协同作用。纤维素酶-乙醇超声提取法得到的干膏得率和总黄酮的含量最高，综合评价指标值最大，超声对滇黄芩总黄酮的溶出也有促进作用。

3.3综合评价比较对滇黄芩总黄酮的提取得率和干膏得率两个指标进行标准化处理，根据影响因素的主次选择不同的加权系数，计算综合评价指标Y值，其提取方法的综合评价比较见表3。

表3　提取方法的综合评价比较

从表3可知Y值的大小顺序为：纤维素酶-乙醇超声提取法>乙醇超声提取法>对煎煮法>乙醇回流提取法>纤维素酶-磷酸缓冲水溶液提取法。说明纤维素酶-乙醇超声提取法适合滇黄芩总黄酮的提取，超声、纤维素酶、乙醇对黄酮类化合物的提取有协同作用。

4结论

在中药制剂提取制备工艺流程中，中药制剂的质量受到多方面的影响，不仅要考虑到主成分的溶出度，也要考虑干膏得率，两者综合评价分析得出最佳提取工艺条件。根据实验结果得出滇黄芩最佳提取方法为纤维素酶-乙醇超声提取法，纤维素酶、超声、乙醇、50℃的适宜水浴温度，不仅使得滇黄芩总黄酮提取率增大，而且杂质的含量明显降低，有利于总黄酮的纯化，为中药中黄酮类成分的提取工艺研究奠定基础。

参考文献

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Comparison and Analysis Different Extraction Methods of Total Flavonoids FromScutellariaamoena

LIU HaiouHU ChunyanPU ChunxiaLIU XiaolingLIN YupingZHAO Shenglan

College of Traditional Chinese Medicine,Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming,650500,China

Abstract:Objective To research the extraction rate of different extraction of total flavonoids from Scutellaria amoena.Methods To optimize the extract technology of flovonoids for Scutellaria amoena,five methods such as water extraction,ethanol extraction, cellulose enzyme-phosphate buffer solution extraction,ethanol ultrasonic extraction method,cellulose enzyme-ethanol ultrasonic extraction method,were useed to extract flavonoids for Scutellaria amoena, also were compared and analyzed the flavonoids by adopting the total content of flavonoids and the yield of dry extract as markers. Results The comprehensive values Y ranked in the order of cellulose enzyme-ethanol ultrasonic extraction,ethanol ultrasonic extraction, water extraction, ethanol extraction, Cellulose enzyme-phosphate buffer solution extraction. Conclusion The optimal method to extract flavonoids for Scutellaria amoena is Cellulose enzyme-ethanol ultrasonic extraction.

Key words:Scutellaria Amoena;Total Flavonoids;Different Extraction Methods；Comparison and Analysis

(收稿日期：2015.12.26)

【中图分类号】R284.2

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517(2016)04-0021-03

作者简介：刘海鸥(1991-)，男，硕士研究生，从事天然产物活性成分研究。Email:462867740@qq.com通信作者：林玉萍(1975-)，女，副教授，硕士，研究方向为天然药物活性成分。Email：11217005@qq.com

基金项目：云南省教育厅重点项目(2014z119)，云南省教育厅项目(2013y239)。