民族药滇牡丹果皮中多糖的提取工艺研究

施　蕊　赵　能　夏　箐　李　彪　王　娟

1.西南林业大学林学院;云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南　昆明　650224；

2.云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，云南　昆明　6502012；

3.云南省林业科学院;云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南　昆明　650201



民族药滇牡丹果皮中多糖的提取工艺研究

施蕊1赵能1夏箐1李彪2王娟3*

1.西南林业大学林学院;云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南昆明650224；

2.云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，云南昆明6502012；

3.云南省林业科学院;云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南昆明650201

【摘要】目的：探索云贵高原和西藏高原特色民族植物滇牡丹果皮多糖的最佳提取工艺。方法：采用单因素实验确定提取溶剂、提取方法和提取次数后，以料液比、提取温度和提取时间为因素，分别设置三个水平设计L9(34)正交试验优化最佳提取工艺。结果：滇牡丹果皮中多糖提取的最佳溶剂为50%乙醇，提取的料液比为1∶40，提取方法为超声辅助提取法，提取次数为3次，每次的提取时间为1.5h，提取温度为40℃；在该工艺条件下，滇牡丹果皮多糖的提取量为(72.73±3.61)mg/g；料液比、提取温度和提取时间对滇牡丹果皮多糖提取的贡献率分别是89.256%、7.702%和1.512%。结论：料液比、提取温度和提取时间显著影响滇牡丹果皮多糖的提取，该工艺条件能够有效提取滇牡丹果皮中的多糖。

【关键词】滇牡丹；果皮多糖；正交实验；贡献率

滇牡丹(PaeoniadelavayiFranch.)是芍药科芍药属(Paeonia)牡丹组(Sect.Moutan)植物[1]，为我国特有的珍贵野生牡丹种质资源[2]。滇牡丹(P.delavayi)分布于横断山区的东南边缘，从昆明经大理、丽江、中甸到西藏察隅，生态幅较广[3-4]，是我国西南特有的珍惜濒危植物，具有较高的观赏价值和药用价值。其籽、果皮含有价值很高的药用成分，多糖有很好的药理活性，比如机体免疫调节功能、降血糖活性、抗衰老作用。朱月等[5]研究表明，青春牡丹(Paeoniarockii‘Qing Chun’)多糖能够清除羟自由基和超氧阴离子，具有抗氧化的作用；万京华等[6]提取的牡丹皮(PaenoinaSuffruticosaAndr.)多糖能够增强吞噬细胞的功能，促进淋巴细胞转化，增强小鼠免疫力。由此可见，牡丹多糖具有很高的药用与保健价值，且多糖含量很丰富，但对于滇牡丹果皮多糖的测定、提取工艺及其生物活性方面的研究未见报道。研究采用正交实验优化滇牡丹果皮中多糖的提取工艺，为研究其多糖的生物活性奠定基础，以期为滇牡丹的开发利用提供思路。

1仪器与材料

1.1仪器BS201S型万分之一电子天平；HH-2型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；LU10AT超声波清洗器；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；N-1001EYELA旋转蒸发仪(东京理化器械独资工厂)；紫外分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)。

1.2材料滇牡丹果皮，采于香格里拉；浓硫酸(分析纯，天津市化学试剂三厂)；4%苯酚：称取4.0g苯酚溶解后定溶到100ml。

2方法

2.1总多糖含量测定多糖类化合物经无机酸处理脱水产生糠醛或糠醛衍生物，生成物能与酚类化合物缩合生成有色物质，溶液颜色会随着溶液浓度的增加而加深。在490nm处有最大吸收，且吸收度与糖含量呈线性关系。精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖50mg置25ml容量瓶中，用蒸馏水定容，然后吸取次液1.25ml置于25ml容量瓶中，加水稀释至刻度，即得浓度为0.10mg/ml的葡萄糖溶液。精密量取葡萄糖标准液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2ml置10ml容量瓶中。分别加入5%苯酚溶液1ml，充分混合后，迅速加入5ml浓硫酸，再充分混合，置于45℃水浴30min后移至冰水浴中，放置30min后取出，在490nm处测其吸收度(A)。以浓度对吸收度做回归，得回归方程。

2.2单因素实验

2.2.1提取方法对滇牡丹果皮多糖提量的影响比较浸渍法、超声波提取法、回流法对滇牡丹多糖含量的影响。浸渍法：精密称取1g果皮于锥形瓶中，加入30ml甲醇，常温浸提1h，抽滤定容;超声波提取法：精密称取1g果皮于锥形瓶中，加入30ml甲醇，常温下超声1h，超声功率为50%，抽滤定容;回流法：精密称取1g果皮于圆底烧瓶中，加入30ml甲醇，回流1h，抽滤定容，分别测定吸光度，每种方法测定3次。

2.2.2提取溶剂对滇牡丹果皮多糖提量的影响分别精密称取滇牡丹果皮1g，置于干净的50ml锥形瓶中，分别加入水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇、甲醇为提取溶剂，料液比为1∶20(V∶V)，超声波提取30min，提取温度为30℃，测定吸光度，计算提取的多糖含量，选取合适的提取溶剂。

2.2.3提取次数对滇牡丹果皮多糖提量的影响分别精密称取滇牡丹果皮1g，置于干净的50ml锥形瓶中，采用80%乙醇为提取溶剂，采用超声波提取30min，料液比为1∶20(V∶V)，分别提取2、3、4、5次，测定吸光度，计算提取的多糖含量，确定最佳提取次数。

2.2.4料液比对滇牡丹果皮多糖提量的影响分别精密称取滇牡丹果皮1g，置于干净的50ml锥形瓶中，采用80%乙醇为提取溶剂，采用超声波提取30min，料液比为1∶10(V∶V)、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，分别提取3次，合并三次提取液，测定吸光度，计算多糖提取率，确定合适的料液比。

2.2.5提取温度对滇牡丹果皮多糖提量的影响分别精密称取滇牡丹果皮1g，置于干净的50ml锥形瓶中，采用80%乙醇为提取溶剂，采用超声波提取30min，料液比为1∶20(V∶V)，提取温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，分别提取3次，合并三次提取液，测定吸光度，计算多糖提取率，确定合适的提取温度。

2.2.6提取时间对滇牡丹果皮多糖提量的影响分别精密称取滇牡丹果皮1g，置于干净的50ml锥形瓶中，采用80%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶20(V∶V)，提取温度分别为40℃，提取时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，分别提取3次，合并三次提取液，测定吸光度，计算多糖提取率，确定合适的提取时间。

2.3数据处理数据采用SPSS17.0进行方差和贡献率分析。

3结果与分析

3.1葡萄糖标准曲线以葡萄糖浓度(C)为横坐标，以吸光度(A)为纵坐标制图，得线性回归方程：Y=63.325x-0.0428(R2=0.9990 )，表明样品在0.001~0.012mg/ml范围内线性关系良好。如图1。

取提取液1ml于10ml容量瓶中用蒸馏水定容，然后再移取0.1ml置10ml容量瓶中，加入1ml 5%苯酚摇匀，再加入5ml浓硫酸，混匀，放置10min后用蒸馏水定容，摇匀，20min后测定吸光度，试剂为空白对照，利用回归方程进行计算即可。果皮多糖提取率(K)按下式计算：K=m/M×100%，式中，m为果皮多糖质量(mg)；M为果皮质量(mg)。

3.2单因素实验结果为选取的方法对滇牡丹果皮多糖进行提取，对比研究了浸渍法、超声波提取法、回流法对滇牡丹果皮多糖的提取得率，并采用单因素实验考察了选取方法中涉及的因素对滇牡丹果皮多糖提取得率的影响，结果见图2。

由图2-a可知，超声波提取法和回流提取法提取的滇牡丹果皮多糖含量没有显著性差异，且均显著高于浸渍法得到的滇牡丹果皮多糖，但考虑到节省时间，因此选择超声波提取法为滇牡丹果皮多糖的提取方法。由图2-b可知，以50%乙醇为溶剂时提取的滇牡丹果皮多糖显著高于以水、30%乙醇、80%乙醇、甲醇为溶剂时的提取量，因此选择50%乙醇为提取溶剂。由图2-c可知，提取次数越多得到的滇牡丹果皮多糖含量越多，提取4次和提取5次后得到的滇牡丹多糖含量没有显著性差异，提取3次和提取4次得到的滇牡丹多糖含量有显著性差异，但是没有达到极显著水平；因此，为节约时间成本，提取次数确定为3次。

由图2-d可知，料液比对滇牡丹果皮多糖的提取率有显著的影响，在实验范围内，提取溶剂越多提取率越高，料液比1∶30、1∶40、1∶50时的提取率之间没有显著性差异，但它们分别显著性高于料液比1∶10和1∶20时的提取率，因此，选择1∶20、1∶30和1∶40为正交实验中料液比的三个水平。由图2-e可知，提取温度对滇牡丹果皮多糖的提取率有显著的影响，在实验范围内，提取温度越高提取率越高，40℃、50℃、60℃时的提取率之间没有显著性差异，但它们分别显著性高于20℃和30℃时的提取率，因此，选择30℃、40℃、50℃为正交实验中提取温度的三个水平。由图2-f可知，提取时间对滇牡丹果皮多糖的提取率有显著的影响，在实验范围内，提取时间越长提取率越高，1.5h、2.0h、2.5h提取率之间没有显著性差异，但它们分别显著性高于0.5h和1.0h的提取率，因此，选择1.0h、1.5h和2.0h为正交实验中提取时间的三个水平。

3.3正交实验设计及其结果基于单因素实验结果，以料液比、提取温度和提取时间为因素，分别设置三个水平设计L9(34)正交试验(见表1)，确定超声提取滇牡丹果皮多糖的最佳提取工艺参数，结果见表2。

表1　正交试验因素水平

由表2可知，料液比、提取温度和提取时间均对滇牡丹果皮中多糖的提取有一定程度的影响。从K值可以看出，在实验水平范围内，料液比和提取温度不同的梯度水平均对多糖的提取量表现为正效应影响，即提取液量越大提取量越大，提取温度越高提取量越大。但是在实验范围内，提取时间并没有表现出和料液比、提取温度相似的正效应影响结果，而是表现为中间水平(1.5h)的提取量最大。从极差(R)可以看出，对滇牡丹果皮中多糖的提取量影响最大的是料液比，其次是提取温度，影响最小的是提取时间。

表2　正交实验提取滇牡丹果皮多糖结果

为进一步分析各因素对实验结果影响是否显著及变异的解释能力[7-9]，对表2的实验结果进行了方差分析和贡献率分析，结果见表3和表4。从表3可以看出，料液比、提取温度和提取时间均对滇牡丹果皮多糖的提取有极显著的影响(P<0.01)，但是不能看出各因素的贡献大小。与直观分析的结果一致，从表4可以看出，料液比对滇牡丹皮中多糖的提取量影响最大，其贡献率是89.256%；其次是提取温度，其贡献率是7.702%；影响最小的是提取时间，其贡献率仅有1.512%。

表3　各因素对滇牡丹果皮多糖提取量的方差分析

表4　各因素对滇牡丹果皮多糖提取量的贡献率

综上，滇牡丹果皮中多糖的最佳提取工艺为A3B3C2，即料液比为1∶40、提取温度为50℃、提取时间为1.5h。优化得到的条件和正价实验中的第9组实验一致，第9组实验得到的滇牡丹果皮中多糖的提取量为(71.90±0.50)mg/g。

3.4实验验证在上述工艺条件下，滇牡丹果皮中提取的多糖含量为(72.73±3.61)mg/g，含量较正交表中最高得率的实验小组(第9组，其提取量为(71.90±0.50)mg/g)提取的高，说明该工艺条件为滇牡丹果皮中总多糖的最优提取工艺。

4讨论

研究表明，牡丹的种仁、花蕊、丹皮中含有大量的多糖，且不同部位的含量不同，不同的提取方法所得含量不同，不同的炮制方式也会多丹皮多糖的含量造成一定影响。谌志伟等[10]采用正交试验优化了牡丹(PaenoinasuffruticosaAndr.)种仁中多糖的最佳工艺为：以料液比1∶20(w/v)混合后，95℃下提取120min，在此条件下牡丹种仁多糖的提取率为3.825%。周远明等[11]通过正交试验优化了牡丹雄蕊中多糖的最佳工艺为：提取温度90℃，料液比1∶15(g∶ml)，提取3次，每次提取3h，刘帅[12]的研究结果与之一致，在此条件下牡丹雄蕊多糖提取率为3.06%。程迪等[13]通过正交实验确定了牡丹皮多糖的最佳提取工艺：以液料比1∶80将物料混合后，50℃下提取20min，重复2次。程迪[13]、于孟琦等[14]采用苯酚-硫酸法测定了河南牡丹(PaenoinasuffruticosaAndr.)皮的多糖含量，该方法测定了多糖浓度与吸光值之间有良好的线性关系。于孟琦等[14]研究不同炮制方法对牡丹皮多糖的影响，认为牡丹皮生品多糖含量为9.31%，酒制品为10.86%，炒黄制品为10.62%，炒焦制品为9.96%，炒炭制品为8.78%。与之稍有不同，熊艳等[15]研究认为不同炮制方式下，丹皮中多糖含量大小顺序为生品>酒制品>炒黄品>炒焦品>炒炭品。

除丹皮、花蕊、种仁等部位中含有多糖外，滇牡丹果皮中也含有大量的多糖，并且提取的工艺条件也和前人的研究有所差异，最佳提取工艺是：提取溶剂为50%乙醇，提取时料液比为1∶40，超声辅助下提取3次，每次提取时间为1.5h，提取温度为50℃；该工艺条件下，滇牡丹果皮多糖的提取量为(72.73±3.61)mg/g。料液比、提取温度和提取时间对滇牡丹果皮多糖提取的贡献率分别是89.256%、7.702%和1.512%。

多糖有很好的药理活性，如机体免疫调节功能、降血糖活性、抗衰老作用。高原特色的滇牡丹，其皮中丰富的多糖药理活性如何，是今后研究云贵高原和青藏高原特色民族植物滇牡丹的重点方向之一。

参考文献

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Research on Extraction Technology of Polysaccharide inPaeoniadelavayiPericarp of National Herbs

SHI Rui1ZHAO Neng1XIA Qing1LI Biao2WANG Juan3*

1.Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China, State Foresty Adiministration, Southwest Forestry University,Kunming 650224,China；2.Key Laboratory of the Ministry of Education for Agro-Biodiversity and Pest Management, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China；3.Key laboratory of Conservation of Rare, Endangered and Endemic Forest Plants, State Forestry Administration,Kunming 650204,China

Abstract:Objective To study research on extraction technology of polysaccharide in Paeonia delavayi pericarp of national herbs distribute on Yunnan-guizhou plateau and the Tibetan plateau.Method Extraction solvent, method and time were determined by using single factor experiment, and process factors including ratio of material to solvent, extraction temperature, extraction times were selected and the optimum parameters were determined for extraction amount of polysaccharide.Result The optimized extraction process as follow: extraction solvent was 50% ethanol, ratio of material to solvent was 1∶40, extraction temperature was 40℃, extraction 3 times for 1.5 hours under ultrasonic assisted. The (72.73±3.61)mg/g polysaccharide was extracted from Paeonia delavayi pericarp under the optimized extraction process. The rate of contribution of ratio of material to solvent, extraction temperature and time were 89.256%,7.702%,1.512%. Conclusion The ratio of material to solvent, extraction temperature and time affected significantly extraction amount of polysaccharide,and the optimized extraction process could extract effectively polysaccharide in Paeonia delavayi pericarp of national herbs.

Key words:Paeonia delavayi；Polysaccharide of Pericarp；Orthogonal Experiment；Rate of Contribution

(收稿日期：2015.12.25)

【中图分类号】R284.2

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517(2016)04-0004-04

作者简介：施蕊(1982-)，女，云南省昆明市人，博士，讲师，主要从事民族药用植物资源的开发利用工作。E-mail:shirui0227@163.com通信作者：王娟(1966-)，女，云南建水人，博士，教授，主要从事生物多样性保护、生态学和竹类植物研究。Email:Schima@163.com

基金项目：国家林业公益性行业科研专项项目(201304105)；云南省森林植物培育与开发利用重点实验室开放基金(2014)；云南省森林灾害预警与控制重点实验室开放基金(ZK14A106、ZK14SB01)；科技部科技基础性工作专项重点项目(2012FY110300)；云南省林业厅省级生态建设专项资金资助。