IGF-Ⅰ腹腔注射对新生大鼠高氧肺损伤的防治作用

张有辰，许春花，池永学，金正勇

(延边大学附属医院，吉林延吉 133000)



IGF-Ⅰ腹腔注射对新生大鼠高氧肺损伤的防治作用

张有辰，许春花，池永学，金正勇

(延边大学附属医院，吉林延吉 133000)

目的观察胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)腹腔注射对新生大鼠高氧肺损伤的防治作用，并探讨其机制。方法将30只新生Wistar大鼠随机分为空气组、高氧组、干预组，每组10只新生。高氧组、干预组制备高氧肺损伤模型，空气组和高氧组、干预组从造模第1天起分别腹腔注射生理盐水和重组IGF-Ⅰ，6 μg/(kg·d)，连续7 d，计算各组肺组织干湿重比(W/D)，计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数，对BALF中的细胞进行Diff-Quik染色，HE染色观察肺组织病理，核染色结合TUNEL观察肺细胞凋亡情况，Western blotting法检测肺组织GRP78、CHOP蛋白。结果干预组、高氧组、空气组大鼠肺组织W/D分别为5.94±0.18、6.38±0.13、5.58±0.21，BALF中白细胞总数分别为(72.37±3.18)×107/L、(166.02±5.36)×107/L、(27.67±1.01)×107/L，高氧组与空气组相比，干预组与高氧组相比，P均<0.05。肺组织病理切片观察可见干预组较高氧组肺水肿减轻。干预组、高氧组、空气组新生大鼠肺细胞凋亡指数分别为10.0%±0.7%、16.3%±0.7%、4.2%±0.9%，高氧组与空气组相比，干预组与高氧组相比，P均<0.05。干预组、高氧组、空气组大鼠肺组织GRP78分别为0.36±0.07、0.43±0.09、0.24±0.04，CHOP分别为1.46±0.11、1.63±0.13、0.62±0.08，高氧组与空气组相比，干预组与高氧组相比，P均<0.05。结论IGF-Ⅰ腹腔注射对新生大鼠高氧肺损伤有防治作用，其机制可能为下调CHOP、GRP78蛋白表达。

胰岛素样生长因子Ⅰ；高氧肺损伤；GRP78蛋白；CHOP蛋白

随着我国近几年新生儿抢救水平的不断提高，新生儿的生存率明显增加，常用于早产儿抢救治疗中的氧疗所导致的肺损伤发生率也呈现逐年上升趋势，并成为降低新生儿生存率的重要因素之一。研究[1]发现，高氧诱导后新生大鼠肺细胞凋亡增加，且随着高氧时间延长其细胞凋亡程度逐渐加重，认为肺细胞凋亡是导致支气管肺发育不良(BPD)的重要原因。胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)是胰岛素生长因子家族成员之一，是由70个氨基酸组成的单链碱性蛋白，是在胎儿生长发育中起重要作用的生长因子[2]。研究[3,4]报道，IGF-Ⅰ通过促进细胞DNA合成和代谢，促使细胞进入G1期，从而有利于细胞增殖，同时通过PI3K/Akt和MAPK信号途径的交叉作用抑制各种细胞凋亡。2013年9月～2016年1月，本研究观察了IGF-Ⅰ腹腔注射对新生大鼠高氧肺损伤的防治作用，并探讨其可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物及试剂 新生Wistar大鼠30只，体质量7～10 g，购自延边大学动物科，动物许可证号：SYXK(吉)2007-0011)。重组IGF-Ⅰ(Sigma公司)，CHOP抗体(Santa cruz公司)，GRP78抗体(Santa cruz公司)，SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒(Solarbio公司)，TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(南京碧波生物科技有限公司)，Diff-Quik染色试剂盒(深圳华康生物医学工程有限公司)。

1.2高氧肺损伤模型的制备将30只新生大鼠随机分为空气组、高氧组、干预组，每组10只。将高氧组与干预组新生大鼠置于玻璃箱内，持续吸入氧气，氧浓度为85%以上，空气组在同一室内吸常压空气，玻璃箱与室内温度为25～26 ℃，湿度为60%～70%。空气组和高氧组、干预组从造模第1天起分别腹腔注射生理盐水和重组IGF-Ⅰ，6 μg/(kg·d)，连续7 d。

1.3观察方法制备模型第7天，各组进行下列操作。 ①肺组织干湿重比(W/D)计算：新生大鼠10%水合氯醛0.7 mL灌肠麻醉后，剪开胸腔，充分暴露肺组织，分离气管和肺组织，结扎右支气管，取下结扎的右肺，擦干肺组织表面，称重后记录肺湿重，置于80 ℃烤箱内，每天称重1次，直至连续2 d重量无明显变化，后置于37 ℃烤箱内，记录肺干重，计算肺W/D。 ②支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数：新生大鼠麻醉后，沿正中线切开颈胸部，并剥离气管周围的肌组织，充分暴露气管颈段并切开，将细静脉管插入气管中，注入1 mL的生理盐水溶液，然后反复回抽3次，取得BALF。将BALF在1 300 r/min、4 ℃下离心10 min，去除上层液，余下细胞用适量的生理盐水溶液反复吹打悬浮，用细胞计数板，显微镜计算白细胞总数。 ③BALF中细胞Diff-Quik染色：载玻片上涂抹BALF的细胞，严格按Diff-Quik染色试剂盒说明书操作，在100倍光学纤维镜下，每组随机抽取细胞涂片，取10个视野记录每平方毫米内的细胞数(N/mm2)，并在100倍的倍率下摄影。④肺组织病理：新生鼠处死后，肺组织用4%多聚甲醛灌注固定20 min，再浸入4%多聚甲醛外固定，常规脱水，透明，浸蜡包埋，超薄切片，作HE染色,每组大鼠各做一张切片。观察各组肺泡发育和损伤程度。⑤肺细胞凋亡情况：将肺组织包埋切片，做核染色结合TUNEL观察各组肺细胞凋亡情况，荧光显微镜下观察各组凋亡细胞。每张切片记录500个肺泡细胞，计算每100个细胞内阳性细胞数，以百分数表示肺细胞凋亡指数。⑥肺组织GRP78、CHOP蛋白检测：采用Western blotting法。组织标本离体后浸泡于液氮中速冻，后置于-70 ℃冰箱内保存。常规匀浆、离心制备组织蛋白抽提液,提取上样8%聚丙烯酰胺凝胶进行还原性SDS-PAGE电泳,半干式转膜(PVDF膜),300 mA恒流40 min。封闭液封闭后PVDF膜过夜,TBS-T缓冲液中充分振荡清洗,分别滴加一、二抗,一、二抗终浓度稀释比例为1∶2 000,ECM显色。X光片曝光后显影、定影、晾干。用凝胶成像系统定量分析结果，用Image J软件测定灰度值，将与β-actin条带灰度值的比值作为其蛋白的相对表达量。

2　结果

干预组、高氧组、空气组大鼠肺组织W/D分别为5.94±0.18、6.38±0.13、5.58±0.21，高氧组与空气组相比，干预组与高氧组相比，P均<0.05。干预组、高氧组、空气组BALF中白细胞总数分别为(72.37±3.18)×107/L、(166.02±5.36)×107/L、(27.67±1.01)×107/L，高氧组与空气组相比，干预组与高氧组相比，P<0.05或<0.01。肺组织病理切片观察可见，空气组肺泡结构完整，间质无水肿，较少炎症细胞浸润；高氧组肺内小血管扩张充血，血管壁及小支气管壁水肿，偶见少量纤维组织增生，肺泡腔及小气道周围可见少量炎症细胞，以中性粒细胞及巨噬细胞为主；干预组与高氧组相比，炎症细胞明显减少，肺水肿减轻。空气组肺组织中可见少量细胞凋亡阳性细胞，凋亡细胞以肺泡上皮细胞、小气道上皮细胞及血管内皮细胞为主。空气组肺细胞DAPI染色，荧光显微镜下核呈均匀的蓝色；高氧组凋亡的肺细胞核呈凝聚的亮白色，肺细胞核内可见亮白色的凋亡小体，TUNEL荧光染色中正常的细胞核不着色，凋亡的细胞核呈绿色圆形小体。干预组、高氧组、空气组新生大鼠肺细胞凋亡指数分别为10.0%±0.7%、16.3%±0.7%、4.2%±0.9%，高氧组与空气组相比，干预组与高氧组相比，P均<0.05。干预组、高氧组、空气组大鼠肺组织GRP78分别为0.36±0.07、0.43±0.09、0.24±0.04，CHOP分别为1.46±0.11、1.63±0.13、0.62±0.08，高氧组与空气组相比，干预组与高氧组相比，P均<0.05。

3　讨论

极低出生体重儿出生后肺发育尚未成熟，需长期暴露于高氧环境中。长时间吸入高浓度氧可引起BPD。有研究[5]报道，长期暴露在高氧中新生大鼠肺损伤的发生与人类新生儿BPD类似，BPD的病理过程已被公认为早期肺水肿及晚期肺间质纤维化、肺泡发育障碍。内质网应激(ERS)与很多疾病的发生、发展密切相关，ERS与高氧肺损伤的关系日益受到关注。研究[6～8]表明，内质网过氧化可影响蛋白质的正确折叠，导致未折叠蛋白反应(UPR)，UPR经其膜上的PERK、IRE1及ATF6等3个跨膜蛋白转导应激信号而发生反应。CHOP是一个ERS应激转录因子,其表达引起凋亡。ERS的标志性分子GRP78在ERS中起关键的调节作用，是细胞的一种重要的防御机制。IGF-Ⅰ作为体内重要的生长因子在组织细胞的增殖、分化、凋亡及机体的生长发育中起重要的调节作用。孕15周时胎儿体内可以检测到IGF-Ⅰ，胰岛素生长因子对胎儿的作用机理尚不十分清楚，但其在胎儿生长发育方面的作用已得到人们普遍认同。在肺发育的各个阶段中IGF-Ⅰ mRNA均有表达，表明IGF-Ⅰ是在肺生长发育中起重要作用的生长因子[9]。研究[10]表明，高氧肺损伤后第3、7天，IGF-Ⅰ、IGF-Ⅰ受体、IGF-Ⅱ表达均增高，且对高氧损伤后的修复有重要意义。生后7 d新生大鼠肺的发育与新生儿出生时相似[11]，本实验采用大鼠高氧肺损伤模型[12]，此模型研究已得到广泛利用与肯定。本实验结果显示，高浓度氧可引起大鼠肺组织W/D明显增加，诱发肺水肿。高氧可引起BALF中白细胞增高，引起肺组织损伤并加重肺细胞凋亡。IGF-Ⅰ能减轻高氧诱导引起的肺水肿及炎症，并对高氧肺细胞凋亡有明显抑制作用，这与文献[13]报道一致。进一步研究发现，高氧可导致大鼠肺组织GRP78、CHOP蛋白表达升高，IGF-Ⅰ能下调其表达。

综上所述，IGF-Ⅰ腹腔注射对新生大鼠高氧肺损伤有防治作用，其机制可能为下调CHOP、GRP78蛋白表达。

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国家自然科学基金资助项目(NO81160083)。

金正勇(E-mail： jinzhengyong2003@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.011

R364

A

1002-266X(2016)23-0036-03

2016-01-04)