Hp感染胃癌患者胃黏膜组织中PTEN表达变化及其机制

陈绮丹,万瑜

(广州番禺区中心医院,广州511400)



Hp感染胃癌患者胃黏膜组织中PTEN表达变化及其机制

陈绮丹,万瑜

(广州番禺区中心医院,广州511400)

目的 探讨幽门螺杆菌(Hp)感染与非感染胃癌患者胃黏膜组织中人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的表达变化及其机制。方法 Hp感染及非感染胃癌患者的胃黏膜组织各50例，分别命名为Hp阳性组和Hp阴性组。采用实时荧光定量PCR和Western blotting法检测两组胃黏膜组织中PTEN、DNA甲基转移酶1(DNMT1) mRNA及蛋白表达；采用巢式降落式甲基化特异性PCR法检测两组胃黏膜组织中PTEN DNA甲基化水平。结果 Hp阳性组胃黏膜组织中PTEN mRNA及蛋白表达水平与Hp阴性组比较降低，差异有统计学意义(P均<0.05)；Hp阳性组胃黏膜组织中PTEN启动子区DNA甲基化水平与Hp阴性组比较升高，差异有统计学意义(P<0.01)；Hp阳性组胃黏膜组织中DNMT1 mRNA及蛋白表达水平与Hp阴性组比较升高，差异有统计学意义(P均<0.05)。结论 Hp感染胃癌患者胃黏膜组织中PTEN表达降低，而PTEN启动子区DNA高甲基化可能是其表达下调的重要机制。

胃肿瘤；幽门螺杆菌；人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因；DNA甲基化；DNA甲基转移酶1

幽门螺杆菌(Hp)不仅是引起消化性溃疡等胃肠道疾病的主要病原菌，其感染导致的慢性胃炎还是致胃癌的危险因素[1，2]，且国际癌症研究机构(WTO-IARC)已将Hp列入第一类致癌因子。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性[3]。文献报道，Hp阳性胃癌胃黏膜组织中PTEN表达水平显著低于Hp阴性的胃癌患者，但其机制仍不清楚[4]。DNA甲基化是表观遗传学调控的重要机制，DNA甲基转移酶1(DNMT1)主要负责维持性甲基化，且其过表达与胃癌的发生亦密切相关[5]。但在Hp相关胃癌中PTEN启动子区DNA甲基化水平是否发生改变及其机制尚未见报道。本研究旨在探讨Hp感染和非感染胃癌患者胃黏膜组织中PTEN启动子区DNA甲基化水平是否发生改变及其机制，为Hp相关胃癌的防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2014年8月～2016年8月于本院消化内科内镜中心内镜下活检的胃癌组织标本。胃癌的诊断标准：纤维胃镜检查结合刷取脱落细胞和钳取活组织检查，镜检可见胃癌病变征象，脱落细胞和活体组织检查找到癌细胞。Hp感染的诊断标准：胃黏膜直接染色涂片镜检，见螺旋形革兰阴性螺旋杆菌，快速脲酶试验阳性。Hp感染和非感染胃癌患者各50例。Hp阳性组：男34例、女16例，年龄25～80(54±6.2)岁。Hp阴性组：男28例、女22例，年龄28～77(56±5.8)岁。所有病例术前未经放化疗治疗。

1.2 胃黏膜组织中PTEN及DNMT1 mRNA表达检测 采用荧光定量PCR法。在Pubmed数据库中查询PTEN及DNMT1并获取其编码序列，采用Premier5.0设计相关引物，PTEN、DNMT1、GAPDH产物长度分别为101、118、115 bp。提取各组胃黏膜组织的总RNA，按逆转录试剂盒说明书将提取的总mRNA反转录为cDNA，逆转录反应条件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，反应体系：cDNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 8.9 μL，2×SYBR Green Mix 12.5 μL，共25 μL。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。以GAPDH表达量为参照，进行相对定量分析。

1.3 胃黏膜组织中PTEN及DNMT1蛋白表达检测 采用Western blotting法。用全蛋白提取试剂盒提取两组胃黏膜组织全蛋白，取20 μL进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，半干转恒压15 V 15 min，5%的脱脂奶粉封闭2 h，与anti-PETN或anti-DNMT1 4 ℃摇床上孵育过夜，HRP标记二抗常温摇床孵育2 h，于凝胶成像分析仪上成像分析，以β-actin表达量为参照，计算PTEN、DNMT1与β-actin条带灰度值的比值。

1.4 胃黏膜组织中PTEN启动子区DNA甲基化水平检测 采用巢式降落式甲基化特异性PCR(nt-MSP)法。按照DNA提取试剂盒说明书操作步骤提取两组胃黏膜组织全基因组DNA，采用亚硫酸盐修饰法对提取的全基因组DNA进行甲基化修饰。nt-MSP法检测PTEN启动子区DNA甲基化程度的改变。针对PTEN启动子区，在线(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)设计一对外引物及两对内引物。外引物扩增体系反应条件：修饰DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL，荧光mix 12.5 μL，共25 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20个循环，每个循环降0.5～50 ℃，72 ℃ 7 min。接着以外引物的PCR产物为模板，进行内外引物的扩增，反应体系及反应条件同外引物。取内引物的PCR产物5 μL进行琼脂糖凝胶上样电泳，凝胶成像分析仪成像，并分析甲基化条带与非甲基化条带的光密度值，按如下公式计算：甲基化(%)=甲基化OD值/(甲基化OD值+非甲基化OD值)×100%。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组胃黏膜组织中PTEN mRNA及蛋白表达比较 Hp阳性组与Hp阴性组胃黏膜组织中PTEN mRNA相对表达量分别为0.598、0.960，蛋白相对表达量分别为0.538、0.940，两组PTEN mRNA及蛋白表达比较，P均<0.05。

2.2 两组胃黏膜组织中DNMT1 mRNA及蛋白表达比较 Hp阳性组与Hp阴性组胃黏膜组织中DNMT1 mRNA相对表达量分别为3.381、1.289，蛋白相对表达量分别为0.827、0.451，两组DNMT1 mRNA及蛋白表达比较，P均<0.05。

2.3 两组胃黏膜组织中PTEN启动子区DNA甲基化水平比较 在线查看PTEN启动子区CpG岛分布情况，结果显示PTEN启动子区富含CpG岛。MSP检测两组胃黏膜组织中PTEN启动子区DNA甲基化水平，结果显示，Hp阳性组与Hp阴性组胃黏膜组织中PTEN启动子区DNA甲基化水平分别为0.561、0.330，两组比较，P<0.05。

3 讨论

Hp感染是一个世界性问题，且中国Hp的感染率较高。Hp引起的慢性胃炎和胃溃疡亦是胃癌的危险因素，Hp感染与胃癌的发生发展密切相关。Hp致病机制复杂，对胃黏膜的损伤不仅与其黏附作用、毒力因子对黏膜细胞的直接损伤有关，而且与其促进胃黏膜炎症、免疫反应等亦有密切联系[6]。文献报道，Hp感染能扰乱部分致癌基因和抑癌基因的功能[7,8]，其中PTEN在胃癌中发挥重要作用[9，10]。

PTEN是近年来在磷酸酶家族中发现的首个肿瘤抑制基因，具有编码蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶活性蛋白的双特异性，广泛作用于多种细胞信号通路，可通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡抑制肿瘤的发生发展、浸润和转移[3]。Zeng等[11]研究表明，在人类胃癌中，miR-370可通过靶向调控PTEN表达进而抑制癌细胞凋亡并促进癌细胞凋亡；Guo等[12]研究表明，假基因PTENP1可通过调节PTEN表达抑制胃癌进展；Kim 等[13]研究表明，活化的PTEN可通过抑制Notch信号通路使胃癌细胞发生细胞周期阻滞。可见，PTEN在胃癌的发生发展过程中发挥重要作用。但以上研究并未区分是否有Hp感染，忽略了Hp在胃癌发生发展中对PTEN的影响。本研究结果显示，Hp阳性组胃黏膜组织中PTEN mRNA及蛋白表达水平显著降低，提示PTEN可能在Hp感染相关胃癌中发挥作用，与文献[4]报道一致。

DNA甲基化是表观遗传学的重要内容，其指CpG位点的胞嘧啶(C)被甲基(-CH3)修饰，从而在基因结构不发生改变的情况下调节基因转录。DNA甲基化改变状态包括低甲基化和高甲基化，一般来讲，低甲基化促进基因表达，高甲基化抑制基因表达。Compare等[14]研究表明基因组DNA低甲基化可能是Hp相关胃癌发生的早期事件；Niwa等[15]研究表明，由Hp感染触发的炎症可导致胃黏膜上皮细胞的异常甲基化。可见，DNA甲基化在Hp感染相关胃癌中发挥重要作用。本研究结果显示Hp阳性组胃黏膜组织中PTEN启动子区DNA甲基化水平显著升高，而DNA高甲基化是基因转录抑制的重要标志，与PTEN mRNA及蛋白表达水平降低相一致；且Hp阳性组胃黏膜组织中DNMT1 mRNA及蛋白表达水平显著升高，与上述结果一致。提示Hp可能通过DNA甲基化抑制PTEN表达从而促进胃癌发生发展。

综上所述，Hp感染可能通过提高DNMT1表达进而提高PTEN启动子区DNA甲基化程度，使其表达水平降低，从而促进Hp相关胃癌的发生，本研究为Hp相关胃癌的防治提供了新思路。

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