IL-17在妊娠期肝内胆汁淤积症患者外周血、蜕膜组织中的表达及意义

任国平，王保莲，王艳红

(新乡市中心医院，河南新乡453000)



IL-17在妊娠期肝内胆汁淤积症患者外周血、蜕膜组织中的表达及意义

任国平，王保莲，王艳红

(新乡市中心医院，河南新乡453000)

目的 观察妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)患者外周血及蜕膜组织中IL-17的表达变化，并探讨其意义。方法 抽选50例ICP患者，其中轻度32例(轻度ICP组)、重度18例(重度ICP组)，选取同期50例健康孕妇作为对照组，采用免疫印迹法、逆转录-聚合酶链反应法检测三组蜕膜组织中IL-17蛋白及IL-17 mRNA相对表达量，采用ELISA法测定外周血IL-17，采用酶循环法检测外周血总胆汁酸(TBA)水平，并对以上指标进行相关性分析。结果 重度ICP组外周血中IL-17、TBA水平及蜕膜组织中IL-17蛋白及IL-17 mRNA相对表达量均明显高于轻度ICP组，且均高于对照组，两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)。ICP患者蜕膜组织IL-17蛋白及IL-17 mRNA相对表达量、外周血IL-17水平均分别与外周血TBA水平呈正相关(r分别为0.575、0.477、0.621，P均<0.05)，且ICP患者蜕膜组织中IL-17蛋白与IL-17 mRNA相对表达量呈正相关(r=0.891，P<0.05)。结论 IL-17在ICP患者外周血、蜕膜组织中表达均升高，检测外周血及蜕膜组织中IL-17表达有利于ICP的诊断及病情评估。

妊娠期肝内胆汁淤积症；免疫调节；白细胞介素17；蜕膜；胆汁酸

妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)是妊娠中晚期并发症，以皮肤瘙痒、黄疸、总胆汁酸(TBA)升高为临床特征[1]。ICP主要危及胎儿，造成胎儿早产、宫内窘迫、死亡等不良结局。其发病机制目前尚不明确，近年来研究发现母胎间免疫功能障碍与ICP发病存在一定相关性[2]。有研究[3]表明，ICP患者外周血Th1型细胞因子表达明显高于健康妊娠妇女，而Th2型下降，Th1/h2值呈升高趋势；同时ICP患者胎盘组织中Th1型细胞因子浓度高于健康妊娠妇女。由此推测，无论是母体系统还是母胎界面，ICP患者均存在Th1/Th2平衡向Th1偏移的现象。Th17是一种不同于Th1和Th2细胞因子的新型CD4+T淋巴细胞亚群，介导机体自身免疫及排斥反应，可产生免疫激活因子。目前国内对于Th17细胞是否参与了ICP发病文献报道较少。而有文献[4]报道，前期、习惯性流产等妊娠并发症中Th17细胞发挥了重要作用。2010年3月～2015年5月，我们对比了健康及不同程度ICP孕妇外周血及蜕膜组织中Th17细胞分泌的IL-17细胞因子水平差异，旨在探讨IL-17在ICP发生中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 50例ICP患者，其中轻度32例(轻度ICP组)，年龄(30.51±3.74)岁，孕周(37.85±0.47)周；重度18例(重度ICP组)，年龄(30.60±3.82)岁，孕周(37.91±0.51)周。ICP诊断及分度参照《妊娠期肝内胆汁淤积症诊疗指南》[5]，轻度ICP:①生化指标:血清TBA 10～39 μmol/L，直接胆红素<6 μmol/L，甘胆酸10.73～43 μmol/L，谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)<200 U/L，总胆红素<21 nmol/L。②出现瘙痒症状，无明显其他症状。重度ICP:①生化指标:血清TBA≥40 pmoI/L，甘胆酸≥43 μmol/L， 直接胆红素≥6 μmol/L，AST、ALT≥200 U/L，总胆红素≥21 nmol/L。②临床瘙痒症状严重，伴其他临床症状。均为单胎初产妇，妊娠期未采用激素等药物治疗，均实施剖宫产终止妊娠。选取同期50例查体健康孕妇作为对照组，年龄(30.73±3.51)岁，孕周(37.88±0.49)周，均实施剖宫产终止妊娠，原因为胎儿宫内窘迫、挤带因素以及头盆不称等，无其他妊娠并发症。三组年龄、孕周比较具有可比性。研究对象及其家属均对本研究内容知情同意，且经医院伦理委员会批准。

1.2 血清TBA、IL-17检测 孕妇均于剖宫产术前抽取2份3 mL外周静脉血,1份置入普通试管，采用日立7060全自动生化分析仪对血清TBA水平进行检测，检测方法依据酶循环法。另1份血标本置于促凝管中，静置2 h后，常温3 000 r/min离心10 min，分离出血清，立即置入-70 ℃冰箱保存待同批检测血清IL-17水平。采用ELISA法检测血清IL-17水平，试剂盒由武汉华美生物公司提供，严格按照试剂盒说明书操作。

1.3 蜕膜组织IL-17 mRNA、蛋白表达检测 术中患者胎盘娩出后，于胎盘附着中央子宫壁轻刮约2 cm×2 cm大小的蜕膜组织，盐水冲洗后，置于-196 ℃液氮内保存，待同批检测IL-17 mRNA及IL-17蛋白相对表达量。①IL-17 mRNA表达检测：a.RNA提取:釆用TRIzol法抽提RNA，研钵洗净，0.1%DEPC浸泡过夜，密封后烘烤12 h。准备各种规格Tip头、EP管、PCR管等无菌无酶管。取冻存蜕膜组织放入液氮预冷研钵中，加入液氮研磨成粉，将TRIzol 1 000 μL加入其中，混匀并转移至1.5 mL EP管中，加入三氯甲烷200 μL混匀离心后取上清液，转移至另一离心管中，加入异丙醇，混合离心，可见白色RNA沉淀。弃上清液，加入现配预冷的75%乙醇1 000 μL吹打离心。吸干管中乙醇，真空干燥，根据RNA沉淀量将灭菌的DEPC 10～20 μL注入其中。采用紫外/分光光度计对RNA水平和光密度值进行检测，采用RQ1 RNase-Free DNase试剂盒(购自美国Promega公司)去除RNA样品中gDNA杂质。b.cDNA合成：将PCR管置于冰上，依次加入RQ1 RNase-Free DNase 10×Reaction Buffer 1 μL，RQl RNase-Free DNase 2 μL。加DEPC水补足至10 μL。轻柔混合，短暂离心后，逆转录条件为37 ℃加热15 min，85 ℃加热5 s后停止反应。c. RT-PCR反应：引物及序列号β-actin F:5′-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3′，R：5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′；IL-17F:5′-TGTCCCCATCCAGCAAGAG-3′，R:5′-CCCACGGACACCAGTATCTTC-3′。以mRNA逆转cDNA为反应模板，设置无酶水代替cDNA为阴性对照组。PCR反应:95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，循环40次；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 h，95 ℃加热10 s生成溶解曲线。IL-17 mRNA相对表达量以2-ΔΔCt表示。②IL-17蛋白表达检测：剪取蜕膜组织样品，根据BCA蛋白定量试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)说明操作，采用免疫印迹法测定蜕膜组织IL-17蛋白浓度。使用分光光度计测定A562吸光度值。根据标准曲线计算出IL-17蛋白浓度。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件统计。计量资料以表示，组间比较采用方差分析；计数资料用率表示，比较采用χ2检验；变量间相关性釆用Pearson相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清TBA、IL-17水平比较 重度ICP组、轻度ICP组、对照组血清TBA水平分别为(54.28±1.69)、(20.58±1.68)、(2.97±1.63)μmol/L，三组两两比较，P均<0.05；重度ICP组、轻度ICP组、对照组血清IL-17水平分别为(23.33±2.04)、(15.48±2.16)、(10.96±2.14)pg/mL，三组两两比较，P均<0.05。

2.2 三组蜕膜组织中IL-17mRNA及蛋白表达比较 重度ICP组、轻度ICP组、对照组IL-17mRNA相对表达量分别为4.71×104±0.71×104、3.77×104±0.74×104、2.03×104±0.73×104，三组两两比较，P均<0.05；IL-17蛋白相对表达量分别为1.19±0.28、0.79±0.31、0.57±0.29，三组两两比较，P均<0.05。

2.3ICP患者蜕膜组织中IL-17蛋白及IL-17mRNA相对表达量与外周血IL-17、TBA相关性分析ICP患者蜕膜组织中IL-17蛋白及IL-17mRNA相对表达量、外周血IL-17水平均分别与外周血TBA水平呈正相关(r分别为0.575、0.477、0.621，P均<0.05)，且ICP患者蜕膜组织中IL-17蛋白与IL-17mRNA相对表达量呈正相关(r=0.891，P<0.05)。

3 讨论

ICP作为一种非正常妊娠状态，其发病机制较为复杂，是多种因素共同作用的结果，至今尚未得到确切阐明。ICP多发生于妊娠中晚期，临床以皮肤瘙痒、血清TBA升高为特征，是妊娠期特有的一种并发症，易造成胎儿不良结局。目前，医学研究公认为妊娠系自然同种半异体移植，妊娠是否成功取决于母胎间免疫耐受平衡，当平衡被打破时，导致病理妊娠发生[6]。CD4+T细胞受到抗原刺激后，可分化为Th1、Th2、Th17及Treg四种不同亚型T细胞，是近年来发现的一种新型细胞亚群，其在细胞因子表达谱及免疫学功能上与一般细胞不尽相同，其中经典Th1/Th2型失衡理论一直占据着ICP疾病免疫学发病机制的主导地位。近年来随着医学研究的不断进展，CD4+T细胞(Th17)在自身免疫相关疾病中亦起重要作用。

Th17细胞主要分泌IL-17，具有免疫激活的生物学作用[7]。细胞因子IL-17的异常升高与机体肝细胞自身免疫损伤有关，临床表现为肝内胆汁淤积、TBA水平升高[8]。其中高血清TBA是ICP的主要生化特点，是其诊断、分度的主要实验室指标。ICP孕妇体内胆汁酸在肝内排泄障碍，造成母体外周血TBA升高，进而损害胎盘胆汁酸转运功能，使母血中的胆汁酸逆向转运至胎儿，且胎盘转运胎儿胆汁酸能力下降，这两方面的共同作用最终引起胎儿胆汁淤积，进而造成对胎儿的毒害作用，包括对胎儿脑、肺、胺带血管等的毒性作用，是ICP早产率、围产儿病死率升高的主要原因[9]。本实验中，重度ICP孕妇外周血中IL-17、TBA水平及蜕膜组织中IL-17蛋白浓度、IL-17mRNA相对表达量均明显高于轻度ICP孕妇，且均高于正常孕妇，两两比较差异有统计学意义，提示母胎界面蜕膜组织IL-17异常表达及外周血IL-17水平升高可能参与了ICP发病，且与其病情严重程度相关。进一步相关性分析显示，ICP孕妇蜕膜组织IL-17蛋白浓度及IL-17mRNA相对表达量、外周血IL-17水平均分别与外周血TBA水平正相关，验证了前文推测的正确性。国内外研究[10，11]证实，IL-17作为重要的炎性介质，其生物学功能多样。首先，其能剌激其他炎性细胞及趋化因子、基质金属蛋白酶水平增高，导致炎性浸润及组织损伤；同时还可协同刺激对CD4+T淋巴细胞活化；其次，IL-17在机体免疫防御中发挥重要作用，如在胞外细菌或真菌侵袭时起介导保护性免疫作用，在自身免疫、过敏性疾病、肿瘤等炎症反应中亦发挥重要作用[12]。因此其高表达与肝脏免疫应答密切相关，参与机体肝脏受损机制。ICP肝内胆汁瘀积病理基础为胆管、肝细胞膜结构异常，导致细胞膜流动发生改变，肝细胞对胆汁摄入、分泌功能异常[13，14]。我们推测，高表达的细胞因子IL-17可能通过激活肝脏免疫应答，造成肝功能受损，从而引发ICP。

综上所述，IL-17在ICP患者外周血、蜕膜组织中表达均升高，检测外周血及蜕膜组织中IL-17表达有助于ICP的诊断及病情评估。

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