梅毒的实验室诊断方法及其应用进展

张丽，赵飞骏，张晓红

(1 南华大学病原生物学研究所，湖南衡阳 421001；2 常德市第一人民医院)

梅毒的实验室诊断方法及其应用进展

张丽1,2，赵飞骏1，张晓红1

(1 南华大学病原生物学研究所，湖南衡阳 421001；2 常德市第一人民医院)

梅毒发病周期长，临床表现复杂，漏诊或误诊率较高，目前尚无对各期梅毒都有高敏感性和特异性的检测方法。本文通过综述梅毒螺旋体显微镜检、梅毒螺旋体非特异性抗体试验、梅毒螺旋体特异性抗体试验及聚合酶链反应技术在各期梅毒检测中的研究及应用进展，为临床医生提供参考意见。对于怀疑一期梅毒但血清学梅毒螺旋体特异性抗体试验检测阴性者，应取分泌物进行病原学检测，或选用聚合酶链反应技术进一步检测，或建议患者定期复查。对于二期、三期及隐性梅毒患者，应首选血清学梅毒螺旋体特异性抗体试验检测。

梅毒螺旋体；实验室诊断方法

梅毒是一种慢性性传播疾病，近年来发病率明显上升；其病原菌是苍白密螺旋体苍白亚种，即梅毒螺旋体(Tp)。梅毒发病周期较长，可侵犯全身各组织器官，临床表现复杂，各期梅毒患者都可伴有无病症的潜伏期，目前临床上并没有对各期梅毒都有较高敏感性和特异性的检测方法。本文对近年来实验室常用的梅毒检测方法及其在各期梅毒诊断中的应用作一综述。

1 显微镜检查

显微镜下可直接检测到Tp，对一、二期梅毒的诊断有重要价值，具有快速、方便、易操作的特点，但常由于Tp含量低、皮损趋于好转或已使用抗菌药物等原因，易出现假阴性。Tp显微镜检查主要包括镀银染色法、墨汁染色法、暗视野显微镜检查法、 直接荧光免疫法(DFA)、多功能显微诊断仪(MDI)检查法和基于免疫组化的动聚焦显微镜检测法(FFM)。镀银染色法、墨汁染色法和暗视野显微镜检查法对操作人员的要求较高，同时多种非致病螺旋体会造成检测结果的假阳性。DFA采用异硫氰酸荧光素标记抗Tp单克隆抗体，Tp阳性者可在荧光显微镜下发出黄绿色荧光，从而排除非Tp的干扰，检测特异性高。MDI检查法是一种综合明暗视野、相差对比及偏振光的多种视频显微检查技术，该方法于显微镜下放大40～15 000倍，可观察到菌体细微结构，同时借助相差光源增强观察的立体感。基于免疫组化的FFM首先要对样本进行免疫组化，再使用动聚焦显微镜进行观察，通过移动显微镜的聚焦、三维立体扫描带菌组织，可检测到极微量的Tp，该方法对三期梅毒的检出率高达87%[1]。MDI和FFM由于仪器比较昂贵，目前尚无法在临床普及。

2 非特异性抗体试验

Tp非特异性抗体试验以卵磷脂、心磷脂及胆固醇作为抗原，检查Tp感染者血清中的反应素(抗类脂抗原抗体)，对一期、二期梅毒的诊断价值较高，主要包括性病研究实验室试验(VDRL)、甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)、血清不加热反应素试验(USR)、快速血浆反应素(RPR) 环状卡片试验等。梅毒患者经治疗好转后，RPR/TRUST滴度可降低或转阴，故RPR/TRUST滴度可以用于判断临床疗效。但由于机体在结核、疟疾等其他疾病过程中也可产生抗类脂抗原抗体，会造成Tp非特异性抗体试验结果的假阳性。脑脊液(CSF)中VDRL法检测结果阳性被认为是诊断神经梅毒的有力证据。研究报道，在CSF中，TRUST、RPR特异性与VDRL相似，而敏感性高于VDRL，可替代VDRL用于神经梅毒的诊断[2]。试剂ITA3 RPR与RPR均可用于检测血清中非特异性反应素的试验，可结合免疫比浊法应用于自动生化分析仪，避免手工法检测的人为误差。Yukimasa等[3]研究报道，ITA3 RPR检测梅毒的敏感性高于传统RPR和VDRL，治疗后的梅毒患者转阴更快。

3 特异性抗体试验

Tp特异性抗体试验是以Tp全菌株或其成分作为抗原，检测患者血清中有无特异性Tp抗体IgG或IgM，检测特异性和敏感性均较高。Tp IgG检测可用于诊断各期梅毒，但对早期梅毒检出率不高，由于Tp IgG可终身携带，故不能作为治愈指标。Tp IgM检测可用于先天梅毒、早期梅毒和神经梅毒的诊断。大分子量Tp IgM不能通过胎盘，因此梅毒孕母的胎儿出生时或出生后不久检测Tp IgM是诊断先天梅毒的重要手段。因为机体感染梅毒后首先产生的抗体是IgM，故梅毒感染早期Tp IgG检测还是阴性时即可出现Tp IgM阳性。Bosshard[4]研究发现，部分Tp明胶颗粒凝集试验(TPPA)阴性的早期梅毒患者，采用ELISA法检测血清Tp IgM可呈阳性；由于梅毒特异性IgM相对分子量大，不能通过血脑屏障，因此CSF中出现Tp IgM是诊断神经梅毒的有力证据。现常用的Tp特异性抗体试验主要有梅毒全株抗原检测特异性抗体试验和梅毒重组抗原检测特异性抗体试验。

3.1 梅毒全株抗原检测特异性抗体试验 梅毒全株抗原检测特异性抗体试验中，荧光Tp抗体吸收试验(FTA-ABS)、Tp血凝集试验(TPHA)、Tp明胶颗粒凝集试验(TPPA)均以Tp全菌株Nichols株作为抗原，检测血清中Tp特异性抗体。FTA-ABS是一种Tp特异性抗体间接免疫荧光法，其对一、二、三期梅毒的敏感性分别为80%、99%～100%、95%～100%，特异性为92%[5]。Lin等[6]研究显示，FTA-ABS-IgM检测早期梅毒的敏感性高于TPPA-IgM。TPHA用羊红细胞作为抗原载体，TPPA则用明胶颗粒作为抗原载体， 后者可避免前者血球自凝造成的漏诊，因此敏感性和特异性均较高。研究报道，TPPA诊断梅毒的特异性为95%～100%，诊断一期、二期及隐性梅毒的敏感性分别为88%、100%、100%[7]。

3.2 梅毒重组抗原检测特异性抗体试验 目前，血清学诊断常用梅毒抗原有TpN15、TpN17、TpN47、TmpA。多种抗原融合可提高检测的敏感性和特异性，常用的嵌合基因有TpN15-47、TpN15-17、TpN17-47、TpN15-47-17、TpN15-TmpA、TpN15-47-TmpA、TpN15-47-17-TmpA，陆续新发现的可用于梅毒诊断的抗原有TpF1、Tp0971、Tp0463、Tp0319、TpGpd、Tp0136 、Tp0821、Tp0319、Tp0663。杨斌等[8]研究发现，Tp47、Tp15和Tp45在各期梅毒中都有较强的表达，可用于梅毒筛查，其中在各期表达有明显差异的Tp41、Tp37和Tp33可考虑作为临床分期观察指标。米希婷等[9]研究显示，Tp17抗体在血清中出现较早，可用于一、二期梅毒的诊断；Tp15抗体在二期梅毒患者血清中的阳性率较一期梅毒高。酶联免疫吸附试验(ELISA)、化学发光免疫分析(CLIA)、免疫印迹试验(WB)、免疫胶体金试验(GICA)、时间分辨荧光免疫测定法(TRFIA)、生物芯片技术、压电免疫传感器法和悬浮芯片技术均以梅毒重组抗原检测血清中特异性梅毒抗体。

3.2.1 ELISA TP-ELISA采用基因重组表达的Tp特异性抗原包被在微孔板上，以辣根过氧化物酶标记，用双抗原夹心法测定患者标本中特异性梅毒抗体。张学杰等[10]采用上海实业科华生物工程有限公司提供的TP-ELISA试剂，检测早期潜伏、一期、二期、三期梅毒阳性率分别为83.3%、100.0%、100.0%、100.0%，总阳性率为96.8%。该方法成本低廉，可实现仪器化检测，是临床大批量标本检测的理想方法，但受标本中一些类过氧化物酶物质的影响，会造成检测结果的假阳性。捕获TP-ELISA-IgM法以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM抗体即可被固相抗体捕获，加入酶标记的特异性TP抗原后可以显色。该方法可排除IgG的干扰，提高IgM检测的敏感性和特异性。Nie等[11]报道了一种新的梅毒ELISA诊断方法，即电浆ELISA法，其测量范围为1～10 ng/mL，检出临界值为0.98 pg/mL，检测敏感性是传统ELISA法的1 000倍。

3.2.2 CLIA TP-CLIA以Tp特异性蛋白制备成固相包被抗原，以辣根过氧化酶标记的Tp特异性蛋白作为检测抗原，与样品中的Tp抗体形成双抗原夹心复合物，加入化学发光底物后测定其发光强度，即可判断样品中是否含有Tp特异性抗体。该方法分辨率较ELISA法高，且不易受血浆中其他物质的干扰。Liu等[12]报道，CLIA法的特异性为99.70%，敏感性为99.00%，既可作为筛选试验，又可作为诊断试验。

3.2.3 WB WB先将电泳分离的特异性抗原转移至固相支持物，然后用特异性抗体作为探针检测靶物质，具有凝胶电泳技术的高分辨率和固相免疫检测高特异性、高敏感性等特点。Novikov等[13]报道WB法对早期梅毒、二期梅毒、神经梅毒的检出率均为100%。另有研究发现，在WB检测中，梅毒早期TpN47抗原对应的抗体区带即可出现，可作为早期梅毒的诊断指标，TpN15和TpN17抗原对应的抗体则有望作为疗效观察指标[14]。

3.2.4 GICT GICT是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。TP-GICT采用纯化的Tp重组抗原，以胶体金作为指示标记，以双抗原夹心法快速检测血清中Tp特异性抗体。其优点为操作简便，结果出现快、易于判读，价格低廉，可用于梅毒快速筛查。Yin等[15]收集来自中国和尼日利亚的1 514例份血清样本，用GICT技术制成的梅毒快速诊断检测试剂进行检测，诊断敏感性达98.3%～99.0%，特异性达97.2%～99.6%。

3.2.5 TRFIA TRFIA是用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨；该方法可排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析敏感性。TP-TRFIA应用镧系元素上金属离子及其赘合物作为示踪物代替酶，标记螺旋体特异性抗原，待抗原抗体复合物形成后，加入增强液，后引入信号放大体系，用时间分辨荧光仪测定终产物的荧光强度，根据相对荧光比值确定待测物浓度。Talha等[16]研究发现，TP-TRFIA特异性高于TP-ELISA。

3.2.6 生物芯片技术 生物芯片技术是通过缩微技术，将大量探针分子固定于硅芯片或玻璃芯片等支持物上，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量检测。Tp生物芯片技术将多种Tp特异性蛋白或基因探针集成到固化支持物上，制成芯片，检测患者标本中特异性梅毒抗体或基因片段。该方法的优点是高通量，微型化，试剂用量少，标本体积小；缺点是生物芯片的制备成本高，检测系统昂贵。Huang等[17]用梅毒特异性蛋白探针TpN15-17-47涂布生物芯片，检测286例梅毒患者的血清样本，结果发现其与 TPPA方法的一致率达到97.9%。

3.2.7 压电免疫传感器法 压电免疫传感器是一种把特异性免疫反应和高灵敏压电质量传感结合在一起的免疫检测方法，具有检测快速、检出临界值低、敏感性高、成本低廉、操作简单等优点，特别适用于野战条件下献血者的快速筛查。单桂秋等[18]将梅毒重组抗原吸附、固定到镀金石英晶体表面，运用压电免疫传感阵列检测技术快速检测梅毒特异性抗体。与ELISA和TPPA作比对，一致率分别为90%和83%。

3.2.8 悬浮芯片技术 悬浮芯片技术利用带编码的微球体作为载体，以流式细胞仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物分子进行大规模检测，具有高通量、多样本、多指标同时检测的优点，且所需样本量小，可自动化操作。陈峰等[19]分别将悬浮芯片技术与ELISA技术用于Tp检测，发现二者的一致率较好，前者检测精确度优于后者。

4 聚合酶链反应(PCR)技术

梅毒PCR技术是一种体外扩增特异性DNA的方法，对早期皮损标本检测敏感性高，但假阳性率较高、试剂成本高、实验室条件要求高，目前只能作为血清学方法的补充。邱伟等[20]运用PCR技术扩增目的基因Tp polA，检测358例疑似初期梅毒患者及66例二期梅毒患者的肛门或生殖器溃疡处拭子标本，结果发现与TPPA检测结果对比，PCR技术适用于初期梅毒诊断，但是对于二期梅毒的诊断价值不及TPPA。

现阶段梅毒PCR诊断常用的靶基因有Tp47和polA，其PCR检测技术主要有常规PCR、巢式PCR、荧光原位杂交技术和实时荧光定量PCR。常规PCR利用已知的待扩增目的基因片段的序列，设计一对相应的引物，以待检标本中的TpDNA为模板，如标本中存在Tp，则可扩增出目的基因。巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性DNA片断，其敏感性是常规PCR的40倍。梅毒荧光原位杂交技术以荧光基团标记的探针与Tp单链核酸杂交，通过荧光检测对Tp进行定性或定量分析。Petrich等[21]以荧光基团标记的探针TpALL(5′-TAGGCTAGTGACTTCGGGTATCTCC-3′)与Tp-16S rRNA杂交，经过荧光检测4例(其中2例HIV阳性)组织病理检查均阴性的梅毒患者，发现结果为阳性，说明其敏感性高于组织病理检查。实时荧光定量PCR是在普通PCR体系中加入一段与目的扩增序列互补的Taqman探针，PCR反应中每扩增出一条产物就会切下一条探针，使报告基团的荧光增加一分，其检测Tp的敏感性约为传统PCR的250倍。

综上所述，血清学检测是梅毒实验室诊断的主要方法，国内多数医院采用敏感性、特异性高，可仪器批量检测，价位也不高的ELISA法进行初筛；采用梅毒特异性试验TPPA进行确诊，并配以简单、成本低廉的梅毒非特异性试验，如RPR法、TRUST法进行梅毒疗效观察、复发或再感染判断。但各期梅毒血清学反应有差异，应有针对性地选择实验室检测方法。怀疑一期梅毒，但血清学检测阴性者，应取分泌物进行病原学检测，或选用PCR法进一步检测，或建议患者定期复查。二期、三期、隐性梅毒者，首选血清学检测。Tp IgM抗体及PCR检测对早期梅毒、神经梅毒、先天梅毒、复发梅毒的诊断及疗效判断有独特优势。同时，开发新的Tp蛋白重组诊断抗原，结合新的可增强检测敏感性的技术方法，找到一些特异性更高、敏感性更好、快速、简便、低成本的检测方法，是目前Tp实验室检测的发展趋势。

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国家自然科学基金资助项目(81373230、81301470)；广东省公益研究与能力建设专项资金项目(2014A020212036)；特殊病原体防控湖南省重点实验室资助项目(湘科计字[2014]5号)。

赵飞骏(E-mail: hengyangzhfj@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.041

R759.1

A

1002-266X(2016)16-0106-04

2015-10-20)