蛋白质组学在腰椎间盘突出症中的研究进展

杨敏，徐桂华

(南京中医药大学护理学院，南京210000)

·综述·

蛋白质组学在腰椎间盘突出症中的研究进展

杨敏，徐桂华

(南京中医药大学护理学院，南京210000)

腰椎间盘突出症(LDH)是骨科常见病与多发病，其机制的初步探明已为LDH的诊断与治疗提供了重要信息，但更深层次的分子机制尚不明了。蛋白质组学注重参与特定生理或病理状态下的所有蛋白质，为筛选疾病特异性生物标记物，探索发病机制与治疗靶点提供了新途径。蛋白质组学的常用技术包括蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术、生物信息学技术以及相对和绝对定量同位素标记技术等，其在研究LDH中医证型诊断，神经根损伤、坐骨神经痛以及腰椎退行性变发病机制中的应用已经比较明确，且取得了一定进展。

腰椎间盘突出症；蛋白质组学；蛋白质分离技术；神经根损伤；腰椎退行性变

腰椎间盘突出症(LDH)是指腰椎间盘各部分发生退行性变后，在外力因素的作用下，纤维环部分或全部破裂，单独或连同髓核、软骨终板向外突出，导致窦椎神经和神经根遭受刺激或压迫，从而引起以腰腿痛为主要症状的一种疾病。LDH为骨科常见病和多发病，占门诊腰痛患者的10%～15%，占骨科腰腿痛住院患者的25%～40%[1]。近年来LDH的发病率呈升高趋势[2]。蛋白质组学技术的研究对象是生命活动的最终执行者——蛋白质，该技术可筛选出与疾病相关的特异性生物标记物，有助于探索发病机制与治疗靶点，为LDH的深入研究提供新思路。

1 蛋白质组学的常用技术

蛋白质组的概念由澳大利亚学者Wilkins和Williams于1994年提出，是指一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质[3]。由其引申出的蛋白质组学则是从整体角度出发，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态，了解蛋白质之间相互作用和联系，使人们能够在分子水平上定量、动态、整体探讨生命活动的规律和生命现象的本质[4]。目前，蛋白质组学的常用技术包括蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术、生物信息学技术及相对和绝对定量同位素标记技术。

1.1 蛋白质分离技术 该技术主要包括双向凝胶电泳(2-DE)、双向荧光差异电泳以及液相色谱(LC)技术等，其中2-DE为最经典、最成熟的蛋白质组学分离技术，它依据蛋白质等电点与相对分子质量的不同而实现蛋白高通量的分离。2-DE技术在第一向IPG 胶条的制备和第二向凝胶的处理方面都有了很大提高，已广泛应用于医学研究。Qian等[5]运用该技术发现了与胆固醇结石形成有关的4种蛋白质；Ayyub等[6]凭借该技术发现了可能对肺癌早期诊断有价值的蛋白生物标记物。

1.2 蛋白质鉴定技术 目前最普遍的蛋白质鉴定技术为生物质谱分析技术，质谱可先将分析物离子化，随后质荷比不同的带电粒子在空间或时间上分离并排列成图谱，根据所形成的图谱对分析物进行检测鉴定[7]。常用的一级质谱技术有基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、电喷射离子井飞行时间质谱以及表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)等。除此以外，二级质谱即同时将两个一级质谱连在一起构成的串联质谱(MS/MS)，因具有较高的特异性与灵敏性，且所需样本量少，逐渐受到研究者的青睐。如串联质谱技术作为新生儿遗传代谢疾病的初筛手段，大大提高了疾病检出率，有助于疾病的早期诊断和治疗，从而降低病死率，改善预后[8]。

1.3 生物信息学技术 经过分离与鉴定，还需对蛋白质的功能和结构进行分析。蛋白质的功能分析一般采用Mascot搜索Swiss-prot、PIR等常用的蛋白质序列数据库，将样品蛋白质与已知蛋白质序列进行比较以了解其功能；也可通过蛋白质的物理性质进行预测，或者与保守基序和图形数据库比较，以判断其功能。相比蛋白质功能的测定，蛋白质结构的测定则困难许多。虽然在PDB等数据库中可检测到蛋白质高级结构的同源性，但蛋白质的折叠过程仍不清晰。蛋白质三维结构的预测是目前最困难、最复杂的预测技术，目前采用的方法有同源模建、threadin算法等[9]。

1.4 相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术 iTRAQ技术是美国应用生物系统公司在2004年推出的一项新的体外同位素标记技术，具有高通量、高灵敏的特点，它的出现促使比较蛋白质组学向定量蛋白质组学升级发展[10]。iTRAQ技术的流程如下：将样品酶分解为肽段后，分别用iTRAQ试剂进行差异标记、混合，最后用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术进行分析。该技术可对同一实验下的8个样品同时进行相对量化，大大降低实验过程中的技术误差，因此很多医学研究者用此技术寻找疾病状态下的特异表达蛋白，以发现治疗药物的新靶点。Ran等[11]通过对15例胃癌患者的胃组织进行iTRAQ技术分析，发现包括嗅质蛋白4在内的4种蛋白质表达上调，且体外研究发现抑制嗅质蛋白4的表达后，胃癌细胞的转移、侵袭与增殖也受到抑制。因此，抑制嗅质蛋白4的表达可能成为未来抗癌药物研制的方向之一。

2 蛋白质组学在LDH中的应用

2.1 在LDH中医证型诊断中的应用 蛋白质组学是研究生物信息学在整体水平上的相互作用，与中医的整体观念不谋而合，并且其客观的研究结果可弥补传统中医辨证指标主观性强的缺点[12]。蛋白质组学运用于LDH的中医证型诊断为研究其辨证规律提供了新思路。许建文等[13]应用SELDI-TOF-MS技术对LDH血瘀证患者、LDH非血瘀证患者和健康人血清蛋白质组学进行了比较研究，发现了11个差异蛋白质点；其采用Biomarker Patterns软件构建LDH血瘀证的血清学诊断模型，结果显示LDH血瘀证患者ROC曲线下面积为0.984，说明该血清学诊断模型的诊断价值较高。赵伟等[14]采用SELDI-TOF-MS技术及蛋白质芯片技术检测壮族LDH血瘀证患者、汉族LDH血瘀证患者、壮族LDH非血瘀证患者和汉族LDH非血瘀证患者的血清样本，共找出13个表达显著差异的蛋白质点，并由此构建出壮族LDH血瘀证的血清学诊断模型；经盲法验证，该模型阳性预测值达到94.44%，表明由13个差异表达蛋白构成的诊断模型可区分壮族与其他民族LDH血瘀证及其他中医证型。以上研究为应用生物标志物进行LDH的中医辨证奠定基础。

2.2 在神经根损伤发病机制研究中的应用 神经根受压是LDH的主要病理特征之一，除了单纯的机械作用，突出的髓核可能引起神经根的生化与免疫反应，从而引起LDH的一系列临床症状。Liu等[15]采集观察组(LDH引起的脊神经根损伤患者)与对照组(椎间盘正常患者)的脑脊液，使用2-DE结合LC-IT-MS技术分析脑脊液蛋白质，结果发现两组间存在15个表达差异的蛋白质点，其中9个在观察组脑脊液中水平升高，包括胱抑蛋白C、载脂蛋白A-IV、维生素D结合蛋白、神经微丝的3种L蛋白、四连接素、免疫球蛋白G和血红蛋白，并通过ELISA法证实了这些蛋白质表达的改变可能与LDH引起的脊神经根损伤有关。有研究建立了大鼠背根神经节持续受压(CCD)模型，28天后处死大鼠，提取蛋白，先通过双向电泳分离蛋白，找出差异表达蛋白质点后运用MALDI-TOF-MS技术进行鉴定，分析所得肽指纹图谱，发现共15种差异表达的蛋白；其中7种蛋白在CCD组表达上调(其中1种蛋白只存在于CCD组)，并推测膜联蛋白A2、p11和蛋白激酶Ce蛋白表达的上调可能参与了神经性疼痛的发生[16, 17]。

2.3 在坐骨神经痛发病机制研究中的应用 LDH是导致坐骨神经痛的主要原因之一，但其机制尚未明确；椎间盘源性痛目前主要依赖经验推测，无法通过临床诊断证实[18]，而蛋白质组学有可能成为该病最有效的生物标记物追踪技术。Xie等[19]借助2-DE结合MALDI-TOF-MS技术，分析了30例由LDH引起坐骨神经痛患者与30位健康志愿者的血清样本，发现了6种差异蛋白质，包括表达升高的载脂蛋白-L1与两种血清白蛋白前体，以及表达降低的载脂蛋白M、四连接素与免疫球蛋白轻链；并通过ELISA法进行反向验证，结果表明载脂蛋白-L1、载脂蛋白M、四连接素以及免疫球蛋白轻链这4种蛋白质可能是与LDH引起的坐骨神经痛相关的生物标志物。

2.4 在腰椎退行性变研究中的应用 腰椎退行性变是LDH发生的致病基础，因此腰椎退行性变后的蛋白质组学研究也成为LDH蛋白质组学研究的重要方向[20]。冯皓宇等[21]采用2-DE联合MALDI-TOF-MS对人正常椎间盘纤维环和髓核细胞外基质分子蛋白进行鉴定，发现了19种相同的蛋白质，为进一步研究这些蛋白质在椎间盘退变过程中的变化打下基础。吕志德等[22]通过2-DE和MALDI-TOF-MS技术确定了正常和退变腰椎间盘组织中的6种差异蛋白质，有助于深入研究这些蛋白质在腰椎退行性变过程中的作用及其机制。Ye等[23]通过对椎间盘退行性变患者与正常患者的纤维环细胞蛋白质表达进行分析，找到了10种差异表达的蛋白质，认为这些蛋白质与椎间盘退行性变的发病有关，并可作为其生物标志物。Yee等[24]采用iTRAQ标记LC-MS/MS技术，发现退变椎间盘组织中Ⅰ型胶原蛋白、纤连蛋白与HTRA1等蛋白表达上调，这种变化在年轻椎间盘退化患者的纤维环组织中亦能观察到，证实椎间盘细胞外基质的改变与其衰老和退化有关。以上研究可为腰椎退行性变生物特异性标记物的确定及靶向药物的研发提供参考。

综上所述，与传统技术注重研究单一蛋白质不同，蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态下的所有蛋白质，这样的优势使其在多个医学领域被广泛研究与应用。LDH的早期防治与发病机制的阐明是目前医学的难点和重点，但蛋白质组学的兴起为该问题的解决带来了新的希望。尽管与骨科其他经典的检验技术相比，蛋白质组学技术尚不成熟，如2-DE技术检测敏感性与分辨率较低，质谱技术对低分子量蛋白质的鉴定效果欠佳等。但是，随着现有技术的不断完善和更多新技术的产生，蛋白质组学技术会为阐明LDH的发病机制、识别早期病变、明确诊断等做出更大的贡献。目前，运用蛋白质组学阐明LDH发病机制的研究正在开展，但是尚缺乏运用该技术探讨蛋白质变化与治疗效果之间关系的研究，今后可从蛋白质组层面阐述LDH的治疗手段。

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国家自然科学基金资助项目(81473791)；江苏省基础研究计划自然科学基金资助项目(BK20141464)；江苏省第四期“333工程”培养基金资助项目。

徐桂华(E-mail: xgh88@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.16.037

R681.5

A

1002-266X(2016)16-0095-03

2015-11-26)