土壤微生物多样性的研究方法

李洁，李睿玉，杨红，马丹炜，全津莹，雷波

（1.四川省农业科学院农业信息与农村经济研究所，四川成都610066；2.四川师范大学生命科学学院，四川成都610101）

土壤微生物多样性的研究方法

李洁1，李睿玉2，杨红1，马丹炜2，全津莹1，雷波1

（1.四川省农业科学院农业信息与农村经济研究所，四川成都610066；2.四川师范大学生命科学学院，四川成都610101）

对土壤微生物多样性的研究方法进行了综述。其中，微生物平板记数法仅能简单反映样品中微生物的类型和数量；从生化方面研究微生物多样性的方法主要包括基于底物利用率的代谢图谱以及磷脂脂肪酸生物标记法；土壤微生物在基因水平上的多样性可以用PCR-DGGE和PCR-TGGE技术、单链构象多态性分析（SSCP）、限制性片段长度多态性（RFLP）和末端限制性片段长度多样性（T-RFLP）等进行研究。荧光原位杂交可通过寡核苷酸探针和全细胞杂交进行原位鉴定和计算单个微生物细胞。目前，基因芯片技术已在微生物检测和群落分析中获得了很大关注，而高通量测序技术使得对土壤微生物转录组和基因组进行全面分析成为可能。

土壤微生物；多样性；研究进展

土壤微生物多样性包括在栖息地中微生物分类群的多样性和在微生物分类群内的遗传多样性以及群落结构的变异性、相互作用的复杂性、营养水平（tropic level）和共位群（guild）数量（功能多样性）在内的生态多样性[1]。目前，对土壤微生物多样性的研究已从传统的微生物平板计数法发展到高通量测序技术，从仅能对土壤微生物类型和数量测定发展到能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序，使得对一个物种的转录组和基因组进行全面分析成为可能[2]。笔者对近年来土壤微生物群落多样性的研究方法进行了概述。

1 微生物平板记数法

微生物平板记数法是一种传统研究微生物多样性的方法，其原理是根据微生物选择相应的专性培养基进行分离培养，然后根据微生物的菌落形态和菌落数来测定微生物的类型和数量[3]。微生物平板记数法操作简单，并且能直接反映样品中微生物的类型和数量。其已被应用于紫茎泽兰等外来菊科植物对入侵地土壤微生物多样性的研究中[4-5]。但是，土壤中的可培养微生物只占微生物总数的1%左右，该方法的结果不能准确反映出土壤中的全部微生物群落结构，需结合其他方法使用[6]。

2 基于生化技术的方法

基于生化技术研究微生物多样性的方法主要包括基于底物利用测定的群落水平生理特征谱图（Community-Level Physiologic al Profiling，CLPP）以及磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acids，PLFAs）生物标记法。

2.1 基于底物利用率的代谢图谱

基于底物利用率测定群落水平生理特征谱图主要是依据微生物利用底物不同的特性来表征微生物群落代谢功能多样性，主要方法有底物诱导呼吸法（Substrate-Induced Respiration，SIR）和Biolog微孔板法。

底物诱导呼吸法是基于微生物在纯培养时利用底物（如葡萄糖）供应在呼吸作用上有直接响应的原理，向土壤中加入足够的葡萄糖，使微生物生物量酶系统达到饱和，这时CO2的释放速率与微生物生物量的大小呈线性相关。因此，可以快速测定土壤微生物生物量。底物诱导呼吸法适用的土壤范围比较广，但受土壤pH值和含水量的影响。另外，底物诱导呼吸法的校正系数的不确定性也使该方法受到争议[7]。

1991年，Garland和Mills首次将Biolog微孔板用来描述微生物群落水平的生理特性[8]。Biolog微孔板的95个孔中加入95种单一碳源和四唑染料，另外一个孔中加水作为对照[9]，因为微生物对单一碳源底物的利用能力不同，当接种菌悬液时会形成不同微生物的指纹。Biolog方法具有快速而可再现的特点。但是，那些不可培养、生长较缓慢的微生物，则不适合该系统的检测。另外，接种密度和培养时间的差异都会给微生物评价结果带来误差。

反映微生物群落对含碳底物代谢功能多样性的群落水平生理特征（CommunityLevel Physiological Profile，CLPP）通常被用来评估微生物群落功能的差异。Campbell和Chapman于2003年提出来的MicroRespTM可用于测定CLPP。这种方法结合Biolog和底物诱导呼吸2种方法的优点[10]，在Biolog技术的基础上结合了碳标记技术，具有耗费低、简单、快速、灵敏等特点，而且测定对象是全土，因此，其被认为是一种具有广阔应用前景的测定群落水平生理特征的方法，已成功应用于土壤微生物功能多样性的分析中[11-13]。

2.2 磷脂脂肪酸法（FAME）

磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acids，PLFAs）是一种有效的生物标记物，可以用来反映土壤中微生物群落的结构。PLFAs存在于所有活细胞中，并且在活细胞中的含量相对恒定[14-15]，在死亡细胞中会迅速分解。脂肪酸甲酯分析法（Fatty Acid Methylester，FAME）是一种生化方法，直接从土壤中提取PLFAs，并根据脂肪酸特异性来了解微生物群落组成，并可对微生物群落进行识别和定量描述。磷脂脂肪酸法已应用于转Bt基因水稻根际土壤[16]、森林土壤[17]、火灾迹地土壤[18]、入侵植物入侵地土壤等微生物多样性的研究上，以及酱香大曲微生物群落结构的研究[19]。该方法结果的准确性与磷脂脂肪酸的提取是否完全有很大关系。

3 基因图谱技术

土壤微生物在基因水平上的多样性可以通过微生物中DNA组成的复杂性表现出来[20]。一些基于DNA分析、PCR扩增的分子生物学技术已经应用于微生物多样性的分析中。

3.1 PCR-DGGE和PCR-TGGE技术

变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）技术最先由Fischer和Lerman提出并用于DNA突变检测。1993年Muyzer将该技术首次应用于微生物生态学研究[21]。后来，在该技术基础上发展出温度梯度凝胶电泳（Temperature Gradient Gel Electrophoresis，TGGE）。目前，PCR-DGGE技术和PCR-TGGE技术广泛应用于土壤微生物多样性的研究中[22-23]。DGGE/TGGE技术在普通的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度/温度梯度。其主要是依据16S rDNA，18S rDNA分子片段的碱基组成差异和二级结构的差异将PCR产物分开。

DGGE技术是在聚丙烯酰胺凝胶中，加入由尿素和甲酰胺2种变性物质形成的由低到高的变性剂梯度，得到具有变性作用的梯度凝胶[24]。因为样品的退火温度（Tm）高低不一，因此，电泳时样品中那些低Tm的双链DNA则在低浓度变性剂作用下就先部分解链，而高Tm的双链DNA则要迁移到具有较高变性剂浓度处才能变性解链[25]。DNA双链一旦解链，其在凝胶中的迁移阻力就会增大，移动的速度就会急剧下降，当其到达某变性浓度，使迁移阻力与电场力相平衡时，就会停留在凝胶的相应位置中，从而使得不同的DNA片断得到分离[26]。TGGE原理与DGGE相似，不同的是TGGE利用温度梯度代替变性剂梯度。PCR产物在具有固定的变性剂浓度和线性温度梯度的胶中迁移，从而造成不同DNA片段解链时间的差异，区分为不同的条带。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夹子，一般30～50个碱基对）可提高DNA片段的解链范围，防止其在最高温度（或变性剂浓度）时完全解链成单链DNA分子，这样能使DNA片段中每个碱基处的差异几乎都能被区分开。

PCR-DGGE技术和PCR-TGGE技术可以直接对土壤样品中的微生物多样性进行分析，具有真实、重复性好、方便快捷，可同时分析大量样品，无需进行分离培养操作等优点。其局限性在于存在PCR误差，需要高保真酶；宏基因组提取时，如果细胞裂解不充分，也将导致试验结果有偏差[27]。

3.2 单链构象多态性分析（SSCP）

单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）分析最初被用于检测DNA点突变。当DNA变性解链为单链时，由于单链DNA的空间构象与分子内碱基组成有关，一个碱基的差异即可形成不同的构象，不同构象的DNA在琼脂糖凝胶电泳上，因泳动速率不同而被分开，故能反映出单链DNA片段的多态性。DNA在琼脂糖凝胶电泳上复性是该方法的潜在问题，Schwieger和Tebbe进一步完善了这个方法，在电泳前去除了DNA双链的一条链，琼脂糖凝胶上的每条链都代表了单一的物种。目前，SSCP已经应用于研究细菌和真菌群落[28-31]、根际微生物区系[32-33]和根际周围从枝菌根真菌的种类[34-35]。该方法优点是不需要DNA片断带GC夹和梯度胶；缺点是PCR扩增特异性要求高，且扩增片段为100～300 bp为佳，易受电泳温度和凝胶浓度等条件的影响[36]。

3.3 限制性片段长度多态性（RFLP）和末端限制性片段长度多样性（T-RFLP）

限制性片段长度多态性（Restrictionfragment Length Polymorphism，RFLP）是一种依据DNA多态性研究微生物多样性的工具。在微生物群落结构分析中，用PCR扩增后的rDNA经酶切位点为4 bp的限制性酶消化后，不同长度的片段可在琼脂糖或者非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上被检测出来。王英等[37]用RFLP技术对免耕水稻土壤中细菌的多样性和空间分布研究发现，细菌种类非常丰富，而且在不同层的土壤中存在空间差异性。

末端限制性片段长度多样性（Terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）技术的原理与RFLP相同，不同的是T-RFLP的一个引物用荧光染料如TET（4，7，2′，7′-四氯-6-羧基荧光素）、6-FAM亚磷酰胺（5′-荧光素氨基磷酸酯）等标记引物，在所得到的PCR产物的一段就带有这种荧光标记。然后，被几种限制性内切酶进行消化，这样带标记物的片段就会在琼脂糖电泳中因为大小不同而分开。由于PCR产物标记的是末端，只有末端带有荧光性标记的片段才能被检测到[38]。

消化产物用测序仪进行测定，输出结果包括片段的大小和数量[39]。T-RFLP技术弥补了RFLP技术的局限性，简化了RFLP的条带图谱，能够更加准确地反映土壤微生物多样性[40]。许乐等[41]采用T-RFLP技术对枯萎病不同抗性的香蕉品种的内生细菌多样性及群落结构进行了分析。Ding等[42]采用T-RFLP技术研究了植物内生细菌的多样性和动态变化。Barreto等[43]用T-RFLP技术研究热带湖泊沉积物中，细菌、古细菌和产甲烷古菌的空间分布规律。该方法优点是不受菌株是否纯培养的限制，不受宿主的干扰，具有特异性强、效率高的特点；缺点是由于PCR扩增中引物存在偏好性、共迁移现象，无法鉴定至种甚至属的水平，导致所能获得的信息量相对较少，不能检测出样品中的全部群落。

4 荧光原位杂交

荧光原位杂交（Fluorescence in Situ Hybridization，FISH）通过寡核苷酸探针和全细胞杂交进行原位鉴定和计算单个微生物细胞。FISH的探针通常是5'端带荧光染料标记的18～30个核苷酸片段，通过荧光显微镜检测细胞rRNA和探针的结合。荧光信号的强度和细胞中rRNA的含量与增长率相关，从而可以检测到细胞的代谢状态。FISH技术与流式细胞术结合可以高分辨率地自动分析微生物群落。FISH技术的缺点是荧光信号强度低和本底荧光干扰，可以通过使用更强的荧光染料、氯霉毒处理使活细菌细胞中rRNA含量增多，用多种荧光染料标记的探针杂交和用报告酶（reporter enzymes）进行信号放大等途径解决这个问题[44]。

酶联荧光原位杂交（Catalyzed Reporter Deposition-FISH，CARD-FISH）在荧光原位杂交技术基础上改进的一种方法。该方法是利用辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）标记的探针和酪胺信号放大（Tyramide Signal Amplification，TSA）技术增强荧光信号的强度[45]。

Li等[46]发展了一种新的成像技术，将FISH和次级离子质谱（Secondary Ion Mass Spectrometry，SIMS）结合，空间分辨率达50 nm，可以在单个细胞水平上定量分析同位素的组成。其原理是用16S rRNA探针杂交，并用生物体内很少见的稳定的同位素标记，一旦探针与样品杂交，NanoSIMS成像就会随即检测到被稳定同位素标记的细胞的微生物特性。FISH技术具有原位、安全、高灵敏度的特点，已被广泛应用于土壤微生物多样性分析中[47-49]。

5 基因芯片

基因芯片技术已在微生物检测和群落分析中获得了很大的关注。其基本原理是用许多已知序列的核酸（探针）与未知的核酸（靶标）杂交进行核酸序列测定，这些探针按特定的排列方式固定在固相载体表面，组成微点阵列[50]。标记的靶核苷酸与基因芯片上的探针杂交，然后通过检测杂交信号，从而定性和定量地获得样品中的遗传信息[51]。其具有高密度、高通量的特点。1997年，微点阵列方法开始应用到环境微生物学中分析微生物群落组成，用9个16S rRNA靶标探针鉴定挑选的硝化细菌。从此，这个领域迅速发展，如今很多芯片系统组成探针应用于测定靶标核酸序列[52-54]。基因芯片技术对于那些特殊的土壤微生物的鉴定非常有效，且具有样品量少、定量的特性。然而对低丰度样品分析时，PCR技术的运用虽然增强了基因芯片检测灵敏性却降低了真实度[55]。此外，由于对探针序列的要求，该方法不适宜检测土壤微生物多样性[56]。

6 高通量测序技术

高通量测序技术（High-throughput Sequencing）是最近几年发展起来的测序技术，又称下一代测序技术（Next Generation Sequencing）[57]。相对于20世纪70年代出现的Sanger双脱氧链终止法测序技术成本高、速度慢，高通量测序技术最显著的特点是高通量[58]，一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序，使得对一个物种的转录组和基因组进行全面分析成为可能[59]。测序流程主要包括：克隆文库的制备、基因组DNA随机片段化和端标记测序及数据分析[60]。高通量测序平台主要包括Roche公司的GS FLX（Genome Sequencer FLX）测序平台，Illumina公司的Illumina Genome Analyzer测序平台，ABI的SOLiD（Supported Oligo Ligation Detetion）测序平台，这3种高通量测序又称为第2代测序技术[61]。其中，GSFLX系统以时间短的优势成为最受欢迎的方法，而Illumina系统数据量大、成本低和SOLiD系统准确度高的特点都将成为今后研究的主要方法[62]。第3代测序技术平台有生物科学（BioScience）公司的HeliScope单分子测序仪（HeliScope Single Molecular Sequencer）、太平洋生物科学（Pacific Biosciences）公司的单分子实时（Single Molecule Real Time，SMRT）DNA测序技术和牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies Ltd）的纳米孔单分子测序技术[14]。第3代测序技术的特点是单分子测序，可以读取片段长达1 kb以上，且准确度高于99.99%[63]。高通量测序技术已被应用到土壤微生物多样性的研究中[64]。

［1］钟文辉，蔡祖聪.土壤微生物多样性研究方法[J].应用生态学报，2004，15（5）：899-904.

［2］Sultan M，SchulzMH，Richard H，et al.Aglobal view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome[J].Science，2008，321：956-960.

［3］沈萍，陈向东.微生物学实验[M].4版.北京：高等教育出版社，2007：28-34.

［4］姚晓华.土壤微生物群落多样性研究方法及进展[J].广西农业生物科学，2008（6）：84-87.

［5］何兵，李睿玉，张红，等.5种外来菊科植物对根际土壤微生物群落和酶活性的影响[J].安全与环境学报，2013，13（3）：176-180.

［6］陈承利，廖敏，曾路生.污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性测定方法[J].生态学报，2006，26（10）：3404-3412.

［7］胡婵娟，刘国华，吴雅琼.土壤微生物生物量及多样性测定方法评述[J].生态环境学报，2011，20（6/7）：1161-1167.

［8］李胜华，刘可星，廖宗文.特征碳源简化土壤微生物Biolog测定的方法及应用[J].中国农业科学，2010，43（3）：523-528.

［9］王强，戴九兰，吴大千，等.微生物生态研究中基于BIOLOG方法的数据分析[J].生态学报，2010，30（3）：817-823.

［10］鲁顺保，郭晓敏，芮亦超，等.澳大利亚亚热带不同森林土壤微生物群落对碳源的利用[J].生态学报，2012，32（9）：2819-2826.

［11］陈晓娟，吴小红，刘守龙，等.不同耕地利用方式下土壤微生物活性及群落结构特性分析：基于PLFA和MicroResp（TM）方法[J].环境科学，2013，34（6）：2375-2382.

［12］MacKenzie MD，Quideau SA.Laboratory-based nitrogen mineralization and biogeochemistry of two soils used in oil sands reclamation[J].Canadian Journal ofSoil Science，2012，92（1）：131-142.

［13］YuJ，GlazerN，Steinberger Y.Carbon utilization，microbial biomass，and respiration in biological soil crusts in the Negev Desert[J].Biology and Fertility of Soils，2014，50（2）：285-293.

［14］Drenovsky R E，Feris K P，Batten K M，et al.New and current microbiological tools for ecosystem ecologists:towards a goal of linking structure and function[J].The American Midland Naturalist，2008，160（1）：140-159.

［15］吴林坤，林向民，林文雄.根系分泌物介导下植物-土壤-微生物互作关系研究进展与展望[J].植物生态学报，2014，38（3）：298-310.

［16］刘摇微，王树涛，陈英旭.转Bt基因水稻根际土壤微生物多样性的磷脂脂肪酸（PLFAs）表征[J].应用生态学报，2011，22（3）：727-733.

［17］田倩，夏汉平，周丽霞.磷脂脂肪酸法分析鹤山针叶林和荷木林的土壤微生物多样性[J].热带亚热带植物学报，2011，19（2）：97-104.

［18］Lombao A，Martín A，Barreiro A，et al.Microbial biomass estimated by phospholipids fatty acids（PLFA pattern）in a soil with different post-fire treatments（seeding，mulching）one year after the experimental fire[J].FLAMMA，2013，4（1）：9-12.

［19］赵金松，郑佳，吴重德.基于磷脂脂肪酸技术研究酱香大曲微生物群落结构[J].应用与环境生物学报，2014，20（4）：558-563.

［20］焦晓丹，吴凤芝.土壤微生物多样性研究方法的进展[J].土壤通报，2005，35（6）：789-792.

［21］赵兴青，杨柳燕，陈灿，等.PCR-DGGE技术用于湖泊沉积物中微生物群落结构多样性研究[J].生态学报，2006，26（11）：3610-3616.

［22］Lorenzo P，Rodríguez-Echeverría S，González L，et al.Effect of invasive Acacia dealbata Link on soil microorganisms as determined byPCR-DGGE[J].Applied Soil Ecology，2010，44（3）：245-251.

［23］Yan Y，Wolkers-Rooijackers J，Nout MJ R，et al.Microbial diversity and dynamics of microbial communities during back-slop soaking of soybeans as determined by PCR-DGGE and molecular cloning[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2013，29（10）：1969-1974.

［24］徐玲玲，刘亚洁，李江，等.变性梯度凝胶电泳在微生物多样性分析中的应用及其技术发展[J].东华理工学院学报，2007，30（3）：279-282.

［25］马俊孝，季明杰，孔健.PCR-DGGE技术在微生物物种多样性研究中的局限性及其解决措施[J].食品科学，2008，29（5）：493-497.

［26］刘权钢，金东淳，刘敬爱.DGGE技术在土壤微生物多样性分析上的研究进展[J].延边大学农学学报，2012，34（2）：170-176.

［27］Green S J，Leigh M B，Neufeld J D.Denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）for microbial community analysis[M]//McGenity T，Van Der Meer J R，De Lorenzo V.Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology.Berlin：Springer，2010：4137-4158.

［28］翁佩芳，吴祖芳，龚业，等.SSCP方法的条件优化与榨菜低盐腌制微生物多样性分析[J].食品与生物技术学报，2011，30（2）：261-266.

［29］Dorn-In S，Hölzel C S，Janke T.PCR-SSCP-based reconstruction of the original fungal flora of heat-processed meat products[J].International Journal of Food Microbiology，2013，162（1）：71-81.

［30］陈娟，焦晓林，杨春勇，等.分离培养方法结合PCR-SSCP技术分析六神曲中的真菌类群[J].中国中药杂志，2014，21（39）：4169-4173.

［31］Omri I，Manaii I，Tlili Z，et al.Analysis of phosphoric ore bacterial and eucaryal microbial diversity by single strand conformation polymorphism（SSCP）and small-subunit（SSU）sequencing[J]. African Journal of Biotechnology，2014，13（30）：3023-3029.

［32］郭欢，曾广萍，刘红玲，等.丛枝菌根真菌对红花根围微生物多样性特征的影响[J].微生物学通报，2013，40（7）：1214-1224.

［33］罗毅，苏有健，张永利，等.不同施肥处理对茶树根际细菌多样性的影响[J].中国农学通报，2014，30（25）：177-183.

［34］Kjoller R，Rosendahl S.Detection of arbuscular mycorrhizal fungi（Glomales）in roots by nested PCR and SSCP（single stranded conformation polymorphism）[J].Plant and Soil，2000，226（2）：189-196.

［35］Sánchez-Castro I，Ferrol N，Barea J M.Analyzing the community composition of arbuscular mycorrhizal fungi colonizing the roots of representative shrub land species in a Mediterranean ecosystem[J]. Journal of Arid Environments，2012，80：1-9.

［36］姜运良，李宁，赵兴波.影响PCR-SSCP的因素分析[J].农业生物技术学报，2000，8（3）：245-247.

［37］王英，滕齐辉，崔中利，等.免耕水稻土壤中细菌多样性及其空间分布的研究[J].土壤学报，2007，44（1）：137-143.

［38］Liu W T，Marsh T L，Cheng H，et al.Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA[J].Applied and Environmental Microbiology，1997，63（11）：4516-4522.

［39］Marsh T L.Culture-independent microbial community analysis with terminal restriction fragment length polymorphism[J].Methods in Enzymology，2005，397：308-329.

［41］许乐，阮小蕾，李冬丽，等.对枯萎病不同抗性的香蕉品种的内生细菌多样性及群落结构[J].微生物学通报，2012，39（9）：1250-1259.

［42］Ding T，Palmer M W，Melcher U.Community terminal restriction fragment length polymorphisms reveal insights into the diversity and dynamics of leaf endophytic bacteria[J].BMC microbiology，2013，13（1）：1.

［43］BarretoDP，Conrad R，Klose M.Distance-decayand taxa-area relationships for bacteria，archaea and methanogenic archaea in a tropical lake sediment[J].PloSOne，2014，9（10）：110-128.

［44］Rogers SW，Moorman TB，OngSK.Fluorescent in situ hybridization and micro-autoradiography applied to ecophysiology in soil[J]. Soil Science Society of America Journal，2007，71（2）：620-631.

［45］Pernthaler A，Pernthaler J，Amann R.Fluorescence in situ hybridization and catalyzed reporter deposition for the identification of marine bacteria[J].Applied and Environmental Microbiology，2002，68（6）：3094-3101.

［46］Li T，Wu T D，Mazéas L，et al.Simultaneous analysis of microbial identityand function usingNanoSIMS[J].Environmental Microbiology，2008，10（3）：580-588.

［47］Lolas I B，Chen X，Bester K，et al.Identification of triclosan-degrading bacteria using stable isotope probing，fluorescence in situ hybridization and microautoradiography[J].Microbiology，2012，158：2796-2804.

［48］陈晨，柏耀辉，梁金松，等.FISH-NanoSIMS技术在环境微生物生态学上的应用研究[J].环境科学，2015，36（1）：244-251.

［49］李大明，成艳红，刘满强，等.双季稻田甲烷排放与土壤产甲烷菌群落结构和数量关系研究[J].农业环境科学学报，2013，32（4）：866-873.

［50］Loy A，Taylor MW，Bodrossy L，et al.Applications of nucleic acid microarrays in soil microbial ecology[M]//Cooper J E，Rao J R. Molecular approaches to soil，rhizosphere and plant microorganism analysis.Welling ford：CAB International，2006：18-24.

［51］Zhou J Z，Thompson D K.Challenges in applying microarrays to environmental studies[J].Current Opinion in Biotechnology，2002，13（3）：204-207.

［52］Xue K，Wu L，Deng Y，et al.Functional gene differences in soil microbial communities from conventional，low-input，and organic farmlands[J].Applied and Environmental Microbiology，2013，79（4）：1284-1292.

［53］王芸，郑华，陈法霖.湿地松和马尾松人工林土壤甲烷代谢微生物群落的结构特征[J].生态学报，2012，32（8）：2458-2465.

［54］陈丹丹，顾胜华，张金娜，等.肠道菌群对免疫系统的影响及其群落分析方法[J].应用与环境生物，2013（3）：68-74.

［55］钟文辉，王薇，林先贵，等.核酸分析方法在土壤微生物多样性研究中的应用[J].土壤学报，2009，46（2）：334-341.

［56］刘国华，叶正芳，吴为中.土壤微生物群落多样性解析法：从培养到非培养[J].生态学报，2012，32（14）：4421-4433.

［57］Schuster S C.Next-generation sequencing transforms today's biology[J].Nature Methods，2008，5（1）：16-18.

［58］秦楠，栗东芳，杨瑞馥.高通量测序技术及其在微生物学研究中的应用[J].微生物学报，2011，51（4）：445-457.

［59］刘建丽，武琳慧，杜瑞芳，等.高通量测序技术在湿地微生物研究中的应用[J].世界生态学，2014（3）：56-63.

［60］王兴春，杨致荣，王敏，等.高通量测序技术及其应用[J].中国生物工程杂志，2012，32（1）：109-114.

［61］谭益民，何苑皞，郭文平.基于分子技术的土壤微生物多样性研究进展[J].中南林业科技大学学报，2014，34（10）：1-9.

［62］解增言，林俊华，谭军，等.DNA测序技术的发展历史与最新进展[J].生物技术通报，2010（8）：64-70.

［63］Metzker ML.Sequencing technologies-the next generation[J].Nature Reviews Genetics，2010，11（1）：31-46.

［64］Ligi T，Oopkaup K，Truu M，et al.Characterization of bacterial communities in soil and sediment of a created riverine wetland complex using high-throughput 16S rRNA amplicon sequencing [J].Ecological Engineering，2014，72：56-66.

Research Methods of Soil Microbial Diversity

LI Jie1，LI Ruiyu2，YANGHong1，MADanwei2，QUANJinying1，LEI Bo1
（1.Institute of Agricultural Information and Rural Economy，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China；2.College ofLife Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，China）

Research methods of soil microbial diversity were summaried in this paper.The microorganism plate numeration only reflected the types and quantity of microorganism in soil.The metabolism map based on substrate utilization and phospholipid fatty acid biology marker methods were used to study the biochemical characters of microorganism.The microbial diversity in genetic level was studied by PCR-DGGE,PCR-TGGE,SSCP,RFLP and T-RFLP.The fluorescence in situ hybridization was used to situ identification and calculate the single microbial cell by oligonucleotide probe and the whole cell hybridization.At present,the gene chip technology was used to microbial detection and microbial group analysis.The high flux sequence technology could be used to analyze the transcript profile and genome of microorganism in soil.

soil microorganism;diversity;research progress

S154.3

A

1002-2481（2016）11-1738-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.11.38

2016-05-26

四川省科技文献共享服务平台（2015-2016）

李洁（1978-），女，四川中江人，助理研究员，硕士，主要从事植物生理及农业信息研究工作。雷波为通信作者。