证候生物学基础的研究——中医药研究的重要突破口＊

赵 瑜，胡义扬，2＊＊

（1. 上海中医药大学附属曙光医院/上海中医药大学肝病研究所/教育部肝肾疾病病证实验室/上海市中医临床重点实验室 上海 201203；2. 上海高校中医内科学E-研究院 上海 201203）

证候生物学基础的研究
——中医药研究的重要突破口＊

赵 瑜1，胡义扬1，2＊＊

（1. 上海中医药大学附属曙光医院/上海中医药大学肝病研究所/教育部肝肾疾病病证实验室/上海市中医临床重点实验室 上海 201203；2. 上海高校中医内科学E-研究院 上海 201203）

证候的客观量化是中医学有待突破的关键科学问题之一，系统生物学及信息分析技术是证本质研究的重要突破口。中医证候与生物网络动态平衡的阐释疾病发生发展的观点具有相通性，网络分析是揭示证候内涵的有效手段，其关键节点可用于证候潜在生物标志物的筛选。方证相应的疗效反馈是验证证候内涵的有效方式，基于药物靶标网络和证候网络“共模块”的比对分析，可以在系统的分子水平上明晰对证方药的作用机制，聚焦证候的潜在标志物，筛选和聚焦所得的证候潜在标志物最终仍需要大量反复的临床实践的验证。目前，中医证候实质的研究发展迅速，但总体尚属起步探索阶段，对证候的生物标志物群多处于初步单一的分析，缺乏对各种组学信息的整合、聚焦和验证。中医证候的研究需要从整体论和转化医学理念出发，立足临床，采用“病-证-方”结合及“整合-聚焦-验证”的体系思路，在严格的临床样本选择与质量控制前提下开展研究工作。

证候 中医药 客观化 系统生物学

中医学的发展以临床疗效为基石，以整体观念和辨证论治为理论和思维特色。辨证论治是中医认识、治疗疾病的基本思想，证候是中医药理论的核心，是中医学认识疾病、临床诊疗和疗效判定的核心基础。所谓“医道在于识证、立法、用方，此三大关键……然三者之中识证尤为重要”，“若识证不明，开口动手便错矣”（《临证指南医案》）。中医证候是一种对患者症状和体征的归纳，反映了疾病过程中机体某一阶段的病因、病位以及病机等整体病理状态。症状和体征是疾病和证候的外在表现。中医学认为“有诸内必形诸外”，疾病证候既然有其规律性的外在表现，就必然有其规律性的内在物质基础。长期以来，缺乏客观量化的证候判定指标及证候疗效评价指标一直是困扰中医药现代化和国际化的瓶颈，同时也是中医学有待突破的关键科学问题之一。

1 系统生物学及其信息分析技术是证本质研究的重要突破口

自20世纪50年代起，中国中医和中西医结合学者针对证候客观化问题进行了不懈的探索，研究者从五脏中的肾本质起步[1]，随后开展脾虚证本质[2]、血瘀证本质[3]等研究，均取得一些进展与成绩。但囿于还原论思想，希望从西医疾病特征指标中找到中医证候客观化指标，同时又限于技术条件所限，未取得根本性的突破。事实证明，以单元的特异指标来解释中医证候的还原论思想难以体现中医证候的整体性的特征。

系统生物学的飞速发展为传统中医客观化的研究建起了更为宽广的技术平台，系统生物学通过采用基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等组学的研究方法，结合信息挖掘分析技术，从多个层面不同角度进行研究探索，体现了整合的思想以及可预测、个体化的新医学诊疗目的[4,5]，其内涵与中医学整体观、治未病、辨证论治和方剂配伍等理论具有相通之处[6]。因此，人们普遍认为在系统生物学时代东西方医学找到了交融点，卫生部长陈竺院士在2005年曾提出“中医强调整体论，西医则强调还原论，所以多年来许多学者认为两者格格不入，但事实证明，到了系统生物学时代，它们找到了共同语言”[7-9]。中医学认为“有诸内必形诸外”，以血液、尿液、粪便等生物样品为窗口，从不同组学层面探测特定证候下的全身病理状态，得到对应“组”、“群”、“谱”调控规律与中医辨证之间的关联性，目前已在寒证、热证、肾阳虚证、肝胆湿热证以及脾虚湿盛证的客观化研究中得到实践并取得了一定成果[10-13]。

本研究团队前期曾从整体论出发，借助信息分析技术和系统生物学检测技术（转录组、代谢组、元基因组等）进行以信息整合为基础的证候生物学基础研究。发现了慢性乙型肝炎中医单一典型证候患者在转录组、代谢组、蛋白质组层面都能与证候分型建立关联关系，即慢性乙型肝炎典型证候患者有明确的生物学物质基础分类，不同证候有其特定的差异物质谱。探索并发现了乙肝或肝硬化患者证候间的差异基因表达谱[14]、蛋白质指纹图谱[15]和差异代谢物谱[16]。通过转录-代谢整合分析挖掘慢乙肝中医证候的特征通路。经差异表达、共变化分析及通路模块富集分析等，发现在固醇代谢和脂肪酸代谢上的不同模式，可能导致这两种证候慢乙肝患者在免疫应答上的不同表现。在肠道菌群的元基因组检测中，研究发现慢乙肝肝郁脾虚和肝肾阴虚患者的肠道菌群实证结构更为相似，肝胆湿热证与两者相比存在明显的差异。证候改变后血清内毒素结合蛋白（Lipopolysaccharides Binding Protein，LBP）含量发生改变，且大多数情况下，肝郁脾虚证血清LBP含量要高于肝胆湿热证。在异病同证方面，以肝胆湿热证为例，发现慢性乙型肝炎和非酒精性脂肪肝肝胆湿热证具有共性的尿代谢差异物谱，其差异物谱主要与糖代谢、氨基酸代谢和外源性化学物质的生物降解和代谢通路相关[10,17]。前期研究提示：证候存在特定的、不同于疾病的生物学基础，系统生物学及信息分析技术为证候客观化研究及证候疗效评价方法的建立提供了技术支持。

2 证候特征性标志物谱的筛选、聚焦和验证

2.1 网络分析是揭示证候内涵的有效手段之一，网络关键节点可用于证候客观标志物的筛选

现有研究已发现运用系统生物学技术，证候可以在物质基础层面明确分类，提示证候确有特定的生物学基础，但是如何从中揭示证候内涵并有效提取可用于临床诊断和疗效评价的量化指标？2004年，Barabasi和Oltva[18]将复杂的生物现象及相互作用抽象的表达为网络，提出了生物网络学的概念，依据该理论，生物的化学平衡是动态平衡，当生物网络为平衡状态时，机体处于健康状态；反之，当网络平衡被扰乱或破坏时即可导致病理或疾病状态。鉴于证候是对动态变化的机体病理生理整体反应状态的外在表现的推理和概括，中医证候的整体观及动态性与生物网络平衡动态的阐释疾病发生发展的观点具有相通性。生物网络的分析方法是揭示证候内涵的有效手段，通过对生物网络拓扑结构分析，可以客观、准确地找出具有特定生物功能的，在网络构成中起关键作用的节点用于证候客观标志物的筛选。Li等[19]发现慢性浅表性胃炎和慢性萎缩性胃炎寒证、热证患者存在代谢-免疫网络的失衡，其中寒证患者表现出较低水平的能量代谢，而热证患者存在过激的免疫应答，通过对网络关键节点的提取，验证得到瘦素是寒证的特异性标志物，CCL2/MCP1是热证的标志物。

2.2 基于药物靶标网络和证候网络“共模块”的比对分析有助于聚焦潜在证候标志物

囿于中医证候的复杂性以及方药的多组分特点，缺乏阐释证候以及药物之间整体性和动态性内在关系的研究方法一直是阻碍证候研究的难题。2007年，英国Hopkins教授借助系统生物学技术，基于网络生物学和生物网络平衡理论率先提出了“网络药理学”的概念[20,21]，摆脱了单一药物通过单一靶点治疗单一疾病的思想限制。依据生物网络的鲁棒性特点，在生物网络非平衡的病理状态下，观察通过药物的“扰动”，从改善或恢复生物网络平衡的整体观角度认识药物与机体的相互作用，为中医证候研究以及方药研究提供了新思路。例如：基于系统药理模型，筛选复方丹参的有效化合物，通过对化合物-靶标、化合物-通路和疾病-靶标数据库的检索和整合，得到具有生物学意义的复方丹参的有效药理网络，用于揭示药物作用机理[22]。王喜军等[23]采用代谢组和蛋白质组学技术，解析了茵陈蒿汤的主要组份的作用机制和组份配伍原理。结果提示，在用药效果上，茵陈蒿汤的3个主要成份DGR的联合应用优于单一组份或任意组份的两两组合。DGR可通过靶蛋白调控分子网络，导致与其相关代谢标志物的动态变化，并且该作用具有协同/累加效应。

上述研究说明网络药理学的研究思路和技术方法是符合中医药特色的有效研究手段，李梢等[24]也在多年研究的基础上，提出构建疾病表型-NEI-药物多层次网络的研究构想，并依据该思路，在药物-疾病分子生物学网络等多层次网络功能模块的对应区域，即网络的“共模块”中探讨药物机理、方证关系，为个体化诊疗，中医药疗效判定等提供依据。中医证候网络和药物靶标网络的“共模块”，是证候和药效机理的共性物质基础，对多层网络“共模块”的比对和研究，有助于在系统的分子水平上探索对证方药的作用机制，“共模块”网络中的关键节点同时是证候判定和药物靶效的重要环节点，有助于筛选并聚焦具有证候诊断和疗效评价功能的潜在证候标志物。

研究团队目前以慢性乙型肝炎常见的肝胆湿热证为研究切入点，借助转录组学检测技术和生物信息网络的分析方法，在对慢性乙型肝炎典型肝胆湿热证进行转录组检测分析，构建慢性乙型肝炎肝胆湿热证的特征性分子生物学网络，阐释证候的病理机制，筛选证候网络关键节点得到候选标志物群；然后采用经典方药茵陈蒿汤对证小样本临床干预，通过对药物“扰动”前后生物网络的比较动态分析，探讨证候网络与方药干预的靶标网络的对应性，从网络共模块中聚焦关键网络节点得到慢性乙型肝炎肝胆湿热证的潜在生物标志物，并进行初步验证，以期为后期扩大样本验证并开发具有临床应用前景的，具备证候判定和疗效评价功能的证候标志物提供现代科学依据。

2.3 方证相应的疗效反馈可有效验证证候内涵，证候的潜在特征性物谱仍需大样本反复的临床验证

传统中医在临床辨证时多受患者主观感受，医者临床经验等主观因素的干扰，因此，研究中医证候，明确诊断问题，不仅需要在事前通过收集症状进行分析，也需要通过正确治疗之后的效应进行反馈和证实。长期以来，中医在临床实践中逐步形成了“方证相应”的诊疗思路。方证一词源于《千金翼方·卷9序文》，曰：“伤寒热病，自古有之，名贤睿哲……今以方证同条，比类相需有检讨，仓卒易知”，而“方证相应”是以“有是证用是方，用是方而治是证”为原则，强调了方剂与证候治疗的对应性。目前，“方证相应”的研究思路已在临床药物疗效判定、方药作用机制研究等层面多有探索和论证。借助该思想可以从辨证论治的中医诊疗终端着手，通过对正确治疗后的疗效反馈，研究药物作用证候的药效靶位和分子机制，以达到逆向佐证辨证的准确性，揭示药理机制，验证证候潜在标志物的目的。例如：Ye等[25]收集了糜烂性胃炎湿热证患者，给予半夏泻心汤治疗两个疗程并采集对应时间点的舌苔，并以健康人为对照。通过检测16S rRNA V4-V5区发现，芽孢菌属一定比例仅存在于黄苔中，随着用药的过程，该菌属的数量不断减少，并且在整个治疗过程中舌苔菌群整体也在向正常菌群不断转化，说明了舌苔微生物与证候诊断及疗效评价的生物标记物的可能性。

最终验证证候本质以及证候标志物准确性的还是需要大样本的反复的临床试验，在此基础上完成成果转化，研发形成稳定表达、操作简便的实用检测产品，服务应用于临床，方可真正困扰中医药现代化和国际化的瓶颈，实现证候的客观化和量化。

3 小结与展望

目前，基于不同角度、不同层次、多形式的中医证候实质的探索虽然已成为一种前景看好的发展趋势，但总体尚属起步探索阶段，缺乏深入和系统性，表现在研究思路上：多“病-证-方”割裂，组学研究分离。基于临床“病-证-方”相结合很少，多数研究采用某一组学方法开展，缺乏组学信息整合的相互印证；缺乏外在和内在整体性信息的整合。在研究方法层面：虽然已知不同证候可在物质基础层面明确分类，但对证候的生物标志物群多处于初步单一的分析，缺乏对各种组学信息的整合、聚焦和验证。基于物质基础的证候科学内涵及病理机制尚未有明确诠释。因此，今后中医证候的研究需要从整体论和转化医学理念出发，立足临床，采用“病-证-方”结合的体系思路，以临床常见、具有代表性的证候为切入点，在严格的临床样本选择与质量控制前提下开展研究工作。同时还需要加强对现有的特征性标志物谱的“整合-聚焦-验证”，对中医证候进行不同组学信息的整合分析，在不同层面上探讨和相互印证证候的科学内涵，进一步聚焦证候的潜在标志性物谱，通过方证对应的临床干预试验对潜在标志物谱进行初步验证，后续通过开展大规模的反复临床验证实践，以期得到稳定表达的证候标志性物谱并实现成果转化，为应对中医临床辨证难题、创新临床适用的中医辨证论治方法体系提供理论和实践基础。

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Traditional Chinese Medical (TCM) Syndrome Research Is a Breakthrough of Chinese Medicine

Zhao Yu1, Hu Yiyang1,2
(1.Shuguang Hospital / Institute of Liver Diseases / Key Laboratory of Liver and Kidney Diseases (Ministry of Education) / Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Medcine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China;
2.E-institute of Traditional Chinese Internal Medicine of Shanghai Municipal Education Commission, Shanghai 201203, China)

The needs of objectification and quantification of TCM syndrome is one of the key scientific issues to be addressed. Systematic biology and bio-information analysis technologies are critical breakthrough in this field. In view of the similarities between the syndrome and biological networks, the inference of network analysis method may be an effective way to reveal the connotation of syndrome and screen syndrome markers. The corresponding decoction efficacy feedback is effectient to verify the connotation of syndrome, and the "comodule"-based comparitive analysis between syndrome molecular biology network and drug target network can unfold the mechanism of prescriptions and focus on potential syndrome biomarkers. The potential biomarkers of syndromes will ultimately need verifying through massive clinical practice. At present, studies of TCM syndrome developed rapidly, though they are under preliminary exploration, lacking the integration, focusing and verification of omics. TCM syndrome research rested on holistic view and translational medicine considering the theories of “disease-syndrome-prescription” and “integration-focus-verification”, and it was pressed ahead under the rigorous clinical sample selection and quality control.

Syndrome, traditional Chinese medicine, objective, systems biology

10.11842/wst.2016.10.001

R2-031

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-10-18

修回日期：2016-10-19

＊ 科学技术部国家“十一五”重大科技专项（2009ZX10004-601）：病毒性肝炎证候生物学基础研究平台的建立，负责人：胡义扬；科学技术部国家“十二五”重大科技专项（2012ZX10005001-004）：基于转化医学的慢性乙型病毒性肝炎中医证候生物学研究，负责人：胡义扬；国家自然科学基金委面上项目（81373857）：基于代谢组和转录组的慢性乙型肝炎患者不同舌象生物学基础研究，负责人：胡义扬；国家自然科学基金委青年科学基金项目（81403298）：基于方证生物网络的慢性乙型肝炎肝胆湿热证潜在标志物研究，负责人：赵瑜；上海市科学技术委员会自然基金项目（14ZR1442000）：基于方-证生物网络的慢性乙型肝炎肝胆湿热证客观化研究，负责人：赵瑜。

＊＊ 通讯作者：胡义扬，本刊编委，研究员，博士生导师，主要研究方向：中医药防治慢性肝病。