基因功能验证研究方法浅述

贾舒安李 彦

(1.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆生产建设兵团第二中学，新疆乌鲁木齐 830002)

基因功能验证研究方法浅述

贾舒安1李 彦2

(1.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆生产建设兵团第二中学，新疆乌鲁木齐 830002)

随着遗传学从宏观到微观水品的进展，分子水平上的研究不断深入和推进，越来越多的基因被得以成功克隆，基因功能的研究显得日益重要，这也是后基因组时代功能基因组学的重要研究内容。本文对基因功能验证研究的方法进行系统综述。

遗传学；功能基因验证；基因功能

遗传学从20世纪开始了由宏观到微观，由形态表型的描述逐步分解到生物体个体分子及功能的研究这一发展过程。1986年美国科学家Thomas Roderick提出了基因组学（Genomics），指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。因此，基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学（structural genomics）和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学（functional genomics），又被称为后基因组（postgenome）研究。鉴定复染性状的分子遗传学基础是现代遗传学亟待解决的问题之一。

1 基因功能的研究方法

目前常用的基因功能的研究方法有：基因敲除，基因诱捕，生物芯片技术，基因过表达技术，RNA干扰等。

1.1 基因敲除（Gene knock-out）

技术是是一种遗传工程技术，主要是利用DNA同源重组原理将外源基因精确地定点地整合到核基因组的特定位置上，最终达到改变细胞遗传特性的目的。目前用于基因敲除的技术有FLPFRT系统、Cre/loxP系统等。该方法通过分析处理前后的细胞表观变化分析整合基因的功能，同时通过系统地改变基因结构也会导致相应地改变，从而分析其蛋白产物各功能区的作用[1-3]。

传统的基因敲除技术依赖于细胞内同源染色体的随机交换，但单纯的依靠同源重组实现基因组的永久修复几率太低，这也大大阻碍了生物学研宄的全面发展。另外，由于胚胎重建技术发展缓慢导致大多数动物尚未建立胚胎干细胞系统，大动物基因敲除的发展受到很大限制。目前只有通过在体细胞中打勒并进行克隆可补弥上述缺陷、实现基因的定点整合，但由于同源重组发生的几率低下（低于10-6）和体细胞扩增能力的极为有限，且在体外经过长期、大量的药物蹄选和培养过程，供体细胞易发生衰老，染色体同样可能受到不同程度的损伤，所以大动物基因敲除模型获得成功的报道目前并不多。

1.2 基因诱捕（gene trap）

是近几年基于小鼠胚胎干细胞和一类报道载体发展起来的一种高通量的基因打IE技术。基因诱捕基本原理是：通过基因诱捕载体导入外源DNA使的内源DNA突变，并插入报告基因。抗性基因的正常表达有利于阳性克隆的蹄选，同时报道基因表达产物可应用于监测内源基因的表达。该技术通过插入使内源基因表达终止，达到突变内源基因的目的，可用于分析基因功能。另外，插入的报告基因可以利用整合位点改变基因的调控元件，模仿内源基因的表达，使得内源基因表达受抑制，达到突变内源基因的目的，通过分析报告基因的时序表达特点，可用于研宄重组部分内源基因的表达特性。

1.3 生物芯片技术

是指在固相基质表面上通过微加工和微电子技术构建的生物化学微型分析检测系统，以实现对机体细胞、组织、糖类、蛋白质、核酸以及其它成分快速、准确的检测。依据研究对象的差异、探针分子的不同和制作工艺的发展，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等[4，5]。

基因芯片又称DNA微阵列、DNA芯片，是生物芯片技术中发展最成熟以及最先实现商品化的技术。基因芯片将大量核苷酸片段（cDNA、表达序列标签或短DNA片段）有序的固定到固相支持物上，通过与样品碱基互补，对核苷酸序列组成进行批量检测。蛋白质芯片也称蛋白质微阵列，是通过利用蛋白质与蛋白质、底物与酶、蛋白质与其它小分子之间的相互影响，监测分析蛋白质的一项技术。鉴于蛋白质更难于在固相承载物表面合成，且其空间构象易于改变而失去生物学活性，所以蛋白质芯片较基因芯片更复杂。考虑到蛋白质是基因表达的最终产物，虽然调控机制复杂，但是较于基因芯片更能全面地反映生命活动的本质，因此其在基因功能研究领域得到广泛的应用。

1.4 基因过表达技术

是将目的基因的全部的编码区片段整合转入特定的细胞中，进而根据细胞生物学行为的相应变化，从而分析该外源基因的相应功能，该方法是目前应用最为广泛、技术最成熟的功能验证的技术手段之一。考虑到基因的转染效率和持续稳定表达情况的影响，过表达载体系统的选择需谨慎[6]。

目前常用的基因过表达载体系统分为非病毒性表达载体以及病毒性表达载体这两种。非病毒性表达载体目前主要通过脂质体介导、磷酸興共沉淀法、显微注射法、电穿孔等方法将携带外源基因的目的质粒导入到受体细胞中，最终实现目的基因在该细胞中的相应的表达。尽管这类载体具有省时省力、操作简便等优势，但是也存在一些局限性。主要面对的问题是：利用质粒载体转染获得稳定表达外源基因的细胞所需时间长、适用于增殖较快的细胞；不同细胞类型对外源DNA的摄取能力有所不同，尤其在对于原代细胞而言这种转染方法几乎是无效的。病毒载体以病毒穿梭颗粒为载体感染宿主细胞的技术，具有转染效率高以及目的基因可稳定表达等优势现已被广泛应用，其中其特别适用于难转染的原代细胞。目前成功构建的病毒载体具有独特的特点，常用病毒载体有慢病毒载体、单纯疱瘆病毒和逆转录病毒载体腺病毒等，应在实际应用中综合考虑细胞类型和实验目的灵活选择适合的病毒载体，达到实验目的。同时，选择合适的强启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚腺苷酸信号等元件，均能使表达效率明显提高。

1.5 RNA干扰（RNA interference，RNAi）

基于机体对外源双链RNA具有抵抗机制的原理，在转录水平上实现的基因阻断技术，是一种双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）在mRNA水平上通过关闭相应的祀基因表达或使其沉默的相关过程，即针对目的序列特异性的转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。从提出至今，这项

技术己应用于多个领域并取得了突飞猛进的发展。作为一种既简单又有效的基因敲除替代的遗传工具，RNA干扰技术大大加速了功能基因组学的研宄进展[7，8]，2001年该技术被Science评为十大科学进展之一，名列2002年十大科学技术进展之首，而后成为基因组学的一个热门研宄领域。

随着RNA干扰技术的不断完善和发展，该技术己经在基因功能研究、信号转导的相关通路研究、治疗病毒感染、抗肿瘤等方面逐步开始应用。除上述作用外，RNA干扰技术还可以用于提高药物敏感性及福射敏感性，在临床上为相关疾病的治疗及新药物的开发提供全新的方向。RNAi抑制基因表达具有高效性、特异性和实效性的特点。另外，RNAi是特定的己知基因序列，通过抑制目的基因的表达而实现基因功能或个体表型的改变，能够特异性地抑制基因的表达来阐明基因在生物体中的功能，应用前景广阔，适用于基因功能验证研宄。

2 TRIB家族

Tribbles（TRIBs）基因是在果蝇体内最早发现的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶样蛋白基因家族，是诱导细胞凋亡，抑制有丝分裂的核基因[9]。在哺乳动物体内有三种TRIBs基因家族成员：TRIB1、TRIB2和TRIB3。它们都含有70～100个氨基酸的N末端和25个氨基酸的C末端[10]。各个成员之间两个末端的氨基酸序列不完全相同，但是它们的中间区都具有丝/苏氨酸蛋白激酶的保守结构域。Tribbles缺少ATP结合位点和激酶激活域，没有可检测到的激酶活性，因此被称为假性激酶，或伪激酶。

2.1 TRIB3研就现状

TRIB3是TRlBs家族成员之一，与家族其他成员相比具有更广泛的生物学功能，在哺乳动物中表达水平高且在不同组织器官的表达水平存在明显差异。在功能上被认为是一种调节蛋白，其通过泛素化或蛋白酶体降解从而调节其它蛋白的活性。TRIB3基因除参与细胞的增殖和分化外，与机体糖脂代谢也有着非常密切的联系。虽然TRIB3没有激酶活性，但实验表明其能与多种细胞因子及核因子结合，在不同的细胞信号通路中发挥着或正或负的调控作用，从而参与应激反应、细胞生长和代谢过程。在哺乳动物中，TRIB3具有高水平表达且富于变化的特征，但是TRIB3在细胞中的确切功能还未被阐明。除参与细胞增殖、分化、肿瘤的发生外，与机体糖脂代谢的调节也密切相关。

Fang N[11]等人研究发现，TRIB3在诱导内质网应激（ER应激）期间，能诱导NF-κB的活化和加重INS-1衍生的β细胞凋亡，从而抑制NF-κB途径的反应，来阻止β细胞凋亡，也就是说TRIB3通过NF-κB信号通路介导内质网应激诱导β细胞的凋亡。

Tiit Örd等人[12]研究发现，TRIB3 mRNA能强烈上调葡萄糖剥夺经由由内质网（ER）传感器激活转录因子4（ATF4）的诱导细胞激酶PERK。在缺乏葡萄糖条件下，细胞存活由TRIB3过表达增强，转为TRIB3沉默，TRIB3上调基因是胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）。IGFBP2 mRNA表达下调的细胞中进行glu-COSE剥夺，并减少IGFBP2表达，加重其过程中缺乏葡萄糖的细胞死亡，而过表达IGFBP2可延长细胞的存活。此外，IGFBP2沉默废除TRIB3的促存活作用。数据表明，IGFBP2通过TRIB3的衰减加速了细胞凋亡。

Zhang LW等人[13]的研究发现，在糖尿病小鼠的肾脏和小鼠肾小球系膜细胞中，TRIB3的表达先增加，后降低，从而阻断ERK1/2MAPK途径，这可能表明TRB3与ERK1/2 MAPK之间是负反馈调节，或者存在其他特殊途径。

Cui XG等人[14]，发现主要通过促进脂肪酸合成的限速酶乙醜辅酶A梭化酶（ACC）的泛素化并将其降解，导致脂质合成减少，进一步促进脂肪分解。基因对于乳脂性状而言为负调控的作用。

功能基因组在评估和检测药物等方面时十分有效，因此也经常用于医药，畜牧兽医，生物工程工作和试验中，应用前景极其广阔。在今后越来越多的研究中，相信功能基因的验证能为遗传学，特别是在基因功能研究领域得到广泛的应用。

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[14] Cui XG，Hou YL，Yang SH，et al.Transcriptional profiling of mammary gland inHolstein cows with extremely different milk protein and fat percentage using RNA sequencing.[J]BMC Genomics，2014，15：226.

贾舒安（1987—），男，山西临汾市人，博士研究生，职位：助理兽医师，从事实验室诊断工作。