猪瘟疫苗生产中存在的问题及工艺改进

郭德民

(哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江哈尔滨 150036)

猪瘟疫苗生产中存在的问题及工艺改进

郭德民

(哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江哈尔滨 150036)

瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)虽然仅有一种血清型，但是其有毒力的强弱之分，如果猪的本身有疾病，则免疫就会失败而达不到免疫的效果。本次研究主要通过对猪瘟疫苗生产中的问题进行探讨，进一步的对猪瘟疫苗生产工艺进行研究。

猪瘟疫苗；猪瘟病毒；生产工艺

当前三种最为常见的猪瘟疫苗是猪瘟乳兔组织活疫苗（组织苗）、猪瘟细胞活疫苗（细胞苗）、猪瘟脾淋活疫苗（组织苗）。给健康的猪接种组织苗同细胞苗的效果相同，如果是紧急接种则组织苗比细胞苗好，主要原因是在组织苗当中的部分组织蛋白，尤其是脾淋苗当中的淋巴因子是免疫促进剂。必须要注意的就是在超前免疫当中不能使用组织苗，因为组织苗对还没有吃到初乳的猪仔能够引发较为严重的免疫应激反应。

1 猪瘟疫苗生产工艺当中存在的问题

1.1 猪瘟病毒培养难

在滴度较低的猪瘟细胞毒转瓶的生产过程当中，病毒的粒子在细胞当中成熟之后就会释放到营养液当中，进而致使部分的病毒粒子活性丧失。生产过程当中，不容易对打次收获病毒的方式进行控制，总的毒价在多次收获病毒之后降低；体外进行培养的细胞当中，CSFV保持较低水平的增殖，产生出的子代病毒有较低的滴度。因此进而配苗抗原就难达到均以稳定质量标准。

1.2 猪瘟病毒抗原的检测方法落后

当前进行增殖的CSFV包括猪肾细胞、羊睾丸细胞还有猪睾丸细胞，一般性的细胞培养过程不会发生细胞的病变，使用兔体的反应量对抗原进行间接性的检测，对抗原进行定量较为困难，对目前疫苗的生产质量影响严重。

1.3 疫苗的效力标准过低

C柱疫苗免疫在欧洲的药典当中规定进行肌肉注射的剂量是100PD。而在我国进行猪瘟苗免疫所规定的标准剂量是37PD。与国际标准相比，我国的标准剂量过低。

1.4 生产方法较为落后

抗原所存在的生物安全性隐患采用兔的淋巴结、脾脏以及乳兔的组织来进行生产。牛病毒性腹泻病毒污染严重威胁着牛睾丸细胞苗；兔源影响兔脾淋苗，有着质量不稳定问题。疫苗的效力检验以及抗原质量的控制均使用较为落后的兔体致热法，检验时需要较大量的兔子，质量指标稳定较难。接种之后兔子能发产生发热反应与兔子对病毒的敏感性以及外界因素有关。显然，如果在接种过程当中兔子感染了别的病原，则不能说明发热反应是因为接种了猪瘟病毒引起的。另外，脾淋苗生产的成本较高，许多厂家是否采用未曾接种的兔子来做脾淋苗值得怀疑。兔子的大小、品种以及健康状况都会对猪瘟病毒在体内的增殖情况产生影响，因此组织苗生产的供体动物严格需要同一品种、统一饲养。

1.5 生产工艺全过程未能达到GMP标准

虽然猪瘟疫苗抗原的部分下游工艺，包括配制、冻干等都在GMP的环境当中进行，但是对兔子进行饲养、接种以及解剖工作要在非GMP的环境当中进行。并且在进行配苗的工序当中不需要在连续性的封闭系统当中进行，需要进行独立性、分散性的操作，进而使得疫苗的抗原完全暴露或者半暴露在外界环境当中，增加了污染的危险性。

2 猪瘟活疫苗生产工艺的改进方向

2.1 猪瘟疫苗生产抗原定量及效力检验方法的改进

有的学者采用进行了原核表达的猪瘟疫苗E2蛋白抗原以及BAIB/c小鼠，通过对CSFV进行单克隆进而建立AC-ELISA的方法，对猪瘟疫苗的临床组织样品、细胞的培养物以及攻毒致死的猪病料进行检测，研究显示此类方法重复性、特异性以及敏感性都较好。此方法可以在较短时间内迅速准确的将大批量的样品中的CSFV检测出来，比病毒分离法以及免疫荧光法优异，其特点是半自动化、自动显示结果，更加适合在研发机构以及生产机构应用。有的学者进行荧光定量PCR（FQ—PCR）检测时将构建的质粒做为了标准，此类方法能够在临床诊断上应用。当前，在国内外已经建立了应用于猪瘟病毒抗体以及抗原检测的ELISA技术，多数为抗体检测技术，大多数在疫苗免疫效果评估以及流行病学党章应用，在疫苗生产抗原的质量控制当中还未应用。在包被抗体以及检测抗体的建立当中使用单克隆抗体作为荧光抗体的方法或者是抗原捕捉ELISA，其特点是特异性高，但是敏感性低；使用多克隆抗体敏感性高，特异性低。有的学者采用噬菌体肽库，在组织样品当中的猪瘟病毒抗原的检测以及诊断当中，设立依赖噬菌体拟位竞争性的ELISA方法。竞争性的ELISA优点是高敏感性、高特异性，此类方法在毒素蛋白以及抗原的检测当中已经得到应用。抗原的准确定量方法可以让配苗当中的抗原和成品的疫苗有效的抗原量化具有更高的准确性和科学性，能够使得猪瘟疫苗的效力变得均一稳定，免疫剂量的准确可以让免疫剂量不足的问题得到避免，同时也可以让因为免疫剂量过大导致免疫抑制的现象得到避免。

2.2 病毒培养方式的改进及抗原的浓缩纯化

采用传代细胞方式对病毒进行生产可以让动物组织以及原代细胞带来的安全风险降到最低甚至可以得到避免，并且含有病毒的培养液当中的病毒含量较高，批次之间的差异较小，稳定性较好。采用ST细胞生物反应器微载体生产猪瘟病毒技术，能够有效的提高CSFV滴度。此类微载体属于一种多孔微珠，可以在悬浮细胞的培养物当中添加，细胞就可以马上在微载体上粘附并生长。因为培养基用量的减少以及细胞培养量的扩大，CSFV滴度得到了显著提高，而且此类微载体通过处理之后可以循环使用。采用生物反应器自动控制参数，可以让产品质量更加的稳定、生产工艺更加的先进。当前我国关于猪瘟抗原浓缩纯化方面的研究较少，可以采用离心和超滤的方法来进行细胞培养抗原的浓缩纯化。有的研究对猪瘟病毒抗原进行纯化采用反向亲和层析法，将抗原当中残存的牛睾丸细胞培养物去除，总的蛋白去除率可以高达76.9%；采用进行纯化前以及纯化后的抗原对猪瘟免疫血清进行检测，猪瘟免疫血清当中的非相关性抗体反应可以通过纯化抗原去除，让猪瘟免疫抗体检测的特异性得到有效确保。

[1] 朱良全，彭隽，王栋，等.猪瘟疫苗研究进展及我国传统疫苗的研究现状[J].中国兽药杂志，2005，39（2）：33-37.