重组伪狂犬病病毒疫苗的研究进展

李佳琪

(新乡市人民公园，河南新乡 453000)

重组伪狂犬病病毒疫苗的研究进展

李佳琪

(新乡市人民公园，河南新乡 453000)

随着分子生物学技术的发展，人们对伪狂犬病病毒的分子学特征研究也逐步深入，根据基因工程原理对伪狂犬病病毒的基因组进行改造，从而构建了多种含有不同外源基因的重组伪狂犬病病毒疫苗。这种疫苗不仅可以为猪的伪狂犬病提供保护，同时还可以产生针对外源保护性抗原的特异性免疫反应，具有广阔的应用前景。笔者在本文中系统地对近些年所报告的多种重组伪狂犬病病毒疫苗的安全性和免疫原性就行了综述，以期为伪狂犬病病毒新的基因工程疫苗的研制提供一定的参考。

伪狂犬病病毒；基因重组；重组活载体疫苗

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是严重危害养猪业的重要病原之一，它可以引起猪的伪狂犬病（Pseudorabies，PR），严重影响了养猪业的健康发展。近年来，以PRV为载体的重组活疫苗发展迅速。

1 伪狂犬病病毒的基因组特征

PRV基因组是线性双链DNA（dsDNA），大小约为145kb，G+C含量高达74%，包含至少70多个基因，这些基因分成4个部分：独特的长区段（UL）、独特的短区段（US）、以及位于US两侧的内部重复序列（IR）和末端反向重复序列（TR）[1]。PRV基因组中已知与毒力有关的基因如下：US区的US3、US4、US6、US7和US8；UL区的UL10、UL13、UL21、UL23（TK）、UL39/40、UL44、UL50。这些基因共同控制着PRV的毒力，缺失其中一个或者多个与病毒复制无关的毒力基因便可以减弱PRV的毒力。

2 与构建重组伪狂犬病病毒有关的基因

以PRV为载体的重组疫苗，一方面可以选择缺失与病毒毒力有关的基因如胸苷激酶（TK）、蛋白激酶（PK）、核苷还原酶（RR）和脱氧尿苷三磷酸激酶（dUTPase），另一方面也可以缺失一些具有免疫原性的非必需糖蛋白如gE，gG，gD等。

UL23基因编码病毒的非结构蛋白胸苷激酶（TK），主要功能是催化脱氧胸苷或嘧啶磷酸化为dTTP，虽然TK基因不是PRV复制所必需的，但是Berns[2]等发现TK基因是PRV的一个主要毒力基因，与病毒在动物体内的潜伏感染以及神经节中的复制有很大关系。因此UL23的缺失对PRV的毒力减弱比较明显，第一代PRV基因缺失疫苗就是通过缺失TK毒力基因获得的疫苗。

US8基因编码gE蛋白，它属于典型的I型蛋白，主要促进病毒通过神经元进入中枢神经系统并在其中转运扩散，同时也加速病毒在感染细胞之间的扩散、融合以及成熟病毒粒子的释放[1]。US7基因编码的gI蛋白与gE蛋白通过非共价键形成异源二聚体，构成病毒囊膜蛋白的一部分，与病毒的毒力密切相关。

US4基因编码病毒复制的非必需糖蛋白gG，这是目前发现的唯一分泌到病毒外的糖蛋白，可以刺激机体产生特异性抗体。gG蛋白不存在成熟的病毒粒子中，由病毒的晚期基因编码，能够影响病毒在细胞间的扩散或感染细胞的凋亡[3]。gG基因在猪感染野毒株和疫苗缺失株的鉴别诊断中具有重要意义。

随着国内外学者对PRV各基因功能研究的深入，特别是对基因UL23，US8/US7，US4等基因的研究，为PRV重组活载体疫苗的设计和构建打下了坚实的理论基础。

3 重组伪狂犬病病毒疫苗的研究

国内外对重组的PRV疫苗的研究主要集中在PRV与猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（CSFV）、口蹄疫病毒（FMDV）等病毒的重组。

3.1 重组的CSFV/PRV的研究

Zijl[4]等最早实现了将病原的保护性抗原基因在伪狂犬病病毒中的表达，并将猪瘟病毒囊膜蛋白基因E1 融合到缺失了TK、gE、11K基因的PRV783-gG 启动子的下游，构建了表达E1 的重组伪狂犬病毒；动物试验显示，该重组病毒在免疫猪体内均能产生对HCV和PRV 高滴度中和抗体，并可以保护免疫猪免受PRV和HCV 的强毒攻击。徐志文[5]等以 PRV 三基因缺失疫苗 SA215 株为载体，通过同源重组和蚀斑筛选的办法获得能稳定表达CSFV E2 基因的重组毒PRV SA215（A）株，接种猪能够同时抵抗PRV和CSFV强度的攻击。J.L.Lei[6]等以现地流行的PRV-TJ变异株为载体构建了能够表达CSFV E2蛋白的重组病毒rPRVTJ-delgE/gI/ TK-E2，并在猪体上评价了其安全性和免疫原性，结果显示，以不同剂量的重组病毒来免疫实验猪，实验组均未表现出明显的临床症状，且在攻毒后猪支的排毒量也显著降低，能同时保护免疫猪免受CSFV和PRV-TJ毒株致死剂量的攻击。

3.2 重组的PPV/PRV的研究

吕建强[7]等将PPV-VP2基因插入到PRV基因组中，构建了表达PPV-VP2基因的重组病毒 PRV TK-/gG-/ VP2+，并且表达蛋白能与 PPV阳性血清发生反应，增殖特性类似亲本株。Q.Hong[8]等等利用 PRV TK-/gE-/LacZ+缺失株，构建了能够表达FMDV 衣壳蛋白前体 P1-2A 和 PPV VP2蛋白的重组 PRV 株，免疫的小鼠能够诱导产生针对PPV、FMDV、PRV的特异性抗体和中和抗体，证实该疫苗株对小鼠的安全性和保护性较好。

3.3 重组的FDMV/PRV的研究

X.M.Li[9]等将FMDV的P1基因的表达盒成功克隆至PRV 弱毒疫苗株（TK-/gG-/LacZ+）的基因组中，成功构建了能够表达FMDV结构蛋白P1的重组毒PRV-P1，免疫的动物体内能够同时产生针对PRV和FMDV的较高水平的中和抗体以及增强CTL对FMDV的应答能力，攻毒后能够保护免疫猪抵抗强毒的攻击。Y.N.He[10]等将包含FMDV潜在的 6个B细胞表位和2个T细胞表位表达盒的多价抗原决定簇基因“FHG”克隆到重组病毒PRV-TK-/gG-/P1+的gE/gI基因位点产生新的重组病毒FHG/P1/PRV，它的免疫原性和只含有FMDV P1蛋白的重组毒相比，免疫猪体内能够产生相似水平的PRV特异性中和抗体，但是增强了对FMDV的特异性中和抗体和细胞免疫反应，重要的是免疫动物体内检测不到gE和gG的特异性抗体，使该重组毒具有了很大了开发价值和应用潜力。

4 小结与展望

随着国内外学者对PRV研究的不断深入，发现其具有很多其它病毒载体不具备的优点：外源基因容量大、免疫持续期长、宿主范围广、成本低、安全性好、不感染人。目前绝大数研究都是以PRV弱毒疫苗为载体，将外源保护性抗原基因插入到PRV复制非必需基因处，通过同源重组和蚀斑筛选的方法获得能够稳定表达外源基因的重组毒株。免疫接种易感动物后，能诱导机体产生同时针对两种病原的特异性体液和细胞免疫应答，由于PRV病毒载体的基因容量比较大，可同时插入多个外源基因，从而实现了免疫一种疫苗可防治多种疾病的目的。因此对这种多价活载体疫苗的研究被认为是最具有应用前景和开发价值的方向之一。但是我们必需理性的认识到一个成功且实用的重组活载体疫苗的构

建，并不仅仅是依据基因工程原理和分子生物技术即可完成的，还必需考虑到插入位点、保护性抗原基因以及免疫保护机制等问题。PRV载体应用中仍然存在一些瓶颈问题没有解决，如一个好的载体系统首先要具备强的启动子以突破目前外源基因表达水平偏低的难关；报告基因在动物体内的表达可能影响目的抗原的免疫原性；载体免疫和目的抗原免疫之间的竞争，因此为了让极具潜力的病毒活载体疫苗早日得到广泛的应用，我们还需要对PRV进行更深入、更全面的机制方面的研究。

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