鹿钩端螺旋体病的病原学诊断

官福跃官福峰

(1.吉林省前郭县畜牧工作总站，吉林前郭 138000；2.吉林省前郭县动物疫病预防控制中心，吉林前郭 138000)

鹿钩端螺旋体病的病原学诊断

官福跃1官福峰2

(1.吉林省前郭县畜牧工作总站，吉林前郭 138000；2.吉林省前郭县动物疫病预防控制中心，吉林前郭 138000)

鹿钩端螺旋体病，又称鹿血尿病，是由钩端螺旋体引起的一种急性传染病。其临床特征是短期发热、黄疸、血尿。

钩端螺旋体病；鹿；诊断

1 病料采集

病鹿生前在发热期间未出现黄疸前颈静脉采取血液，加1/10量的10%枸橼酸钠或1%草酸钠溶液混合。发病6～10d后采取中段尿液。采取实质器官如肝、脾、肾、脑等应不迟于死后1～3h。

2 镜检

（1）材料。液体材料均用1500转/min离心5mn，血液标本取上层液，尿标本取上清液，再以3000～4000转/min离心1～2h，然后取沉淀物制片。肝、肾组织制成1：5或1：10悬液，用1500转/ min离心5min，取上清液制涂片；或再以3000转/min离心0.5～1h，然后取沉淀物制片。

（2）用姬姆萨染色法。涂片自然干燥，浸于盛有甲醇的玻璃缸中或滴加甲醇数滴于玻片上固定3～5min，干后将玻片浸于盛有姬姆萨染色液的染色缸中，染色0.5h至数小时，水洗，吸干镜检，钩端螺旋体呈红色或紫色。

（3）方登纳氏镀银染色法。标本制成薄层涂片，自然干燥；用固定液（冰醋酸1毫升、40%甲醛10ml及蒸馏水100ml混合）1～2min；加无水乙醇数滴，洗去固定液；滴加鞣酸媒染剂（鞣酸5g、蒸馏水100ml），并加热使发生蒸汽，染色30min；用水冲洗后，滴加经氨液处理的硝酸银溶液（硝酸银5g、蒸馏水100ml，取20ml，滴加10%氨液至所产生的褐色沉淀经摇动后恰能完全溶解为止，然后再滴加硝酸银溶液数滴，以溶液于摇匀后仍显轻度浑浊为度），加热使产生蒸汽，染30min；水洗、干燥，加盖玻片，用加拿大树胶固封，用油镜检查。可见底黄，菌黑，菌体与背景界限清晰，菌体形态大多数为两头尖的梭形，有部分没有螺旋，有时菌形弯曲如蚯蚓，菌体长短与红细胞直径相似。

（4）钩端螺旋体媒染法。抹片经火焰固定后用生理盐水漂洗；加媒染剂（鞣酸2g、钾明矾1g及中国蓝0.25g，加于20%乙醇100ml中，充分溶解后过滤即成）5min；水洗后，用染色液（石炭酸复红及碱性美蓝染色液等量混合过滤即成）染色2min；水洗晾干后镜检。钩端螺旋体呈淡红色，背景淡蓝色。

3 病原分离培养

（1）培养基。钩端螺旋体常用培养基为柯托夫（Korthof）氏培养基、捷尔斯基赫氏培养基和希夫纳氏培养基等。

柯托夫氏培养基：蛋白胨0.8g，氯化钠1.4g，氯化钾0.04g，碳酸氢钠0.02g，磷酸氢二钠（含2H2O）0.96g，磷酸二氢钾0.18g，1%氯化钙溶液4ml，蒸馏水1000ml。于l00℃加热30min，冷后调pH至7.2。分装试管每管5ml或10ml，以30min灭菌。

捷尔斯基赫氏培养基：取M/15磷酸氢二钠溶液8ml与M/15磷酸二氢钾溶液2ml混合，再加入蒸馏水90ml即可。定量分装，灭菌方法同上。

上述培养基用前无菌加入10%健康兔血清（经56～58℃水浴灭能2h），即可供培养用。

（2）病原培养方法。①无菌采取病鹿血液，同时接种三管培养基，第一管加1滴、第二管加2滴、第三管加3滴。②无菌采集病鹿新鲜中段尿液接种于数管培养基内，也可以3000转/min离心30in，取沉淀物1～2ml进行培养。为防尿内污染杂菌，可在培养基内加入0.05磺胺嘧啶，亦可用赛氏滤器滤出杂菌。③用作培养的脏器主要是肝和肾。用吸管采集。为了从脏器内的不同部位多吸取些粉碎的组织出来，将插入脏器内的吸管扭向不同方向，取得的材料接种到2～3管培养基内。也可用无菌剪刀剪碎组织进行培养。

（3）分离培养物的鉴定

①培养特性：将已接种的培养管置于28～30℃温箱内。每5天作一次悬滴压片在暗视野显微镜下观察其生长情况。钩端螺旋体通常在7～20d内开始生长，有时要到30～60d，甚至90d才出现。

②生化特性：钩端螺旋体不发酵糖类，不产生H2O2，过氧化氢酶试验阴性，有轻度的还原作用。对氧化物敏感，在人工培养基上继代可逐步消失致病性，但连续通过动物体则可保持其致病性不变。

③菌体形态：菌体形态大多数为两头尖的梭形，有部分没有螺旋，有时菌形弯曲如蚯蚓，菌体长短与红细胞直径相似。

（4）动物接种

①试验动物：14～18日龄仔兔（体重250～400g）、幼龄豚鼠（体重150～200g）、20～25日龄的仔犬以及地鼠对钩端螺旋体的敏感性较高。接种前应测量2～3d体温，正常者才可应用。

②接种材料：从发病3～5d的患病鹿采集血液，立即给动物腹腔注射，剂量为豚鼠、地鼠3ml，仔兔、仔犬5ml。采集中段尿直接或经离心取沉淀物给动物腹部皮下注射。注射前可在尿内混加适量磺胺嘧啶。尿液的注射量为5～10ml。取死亡动物的肝和肾（重量不超过5g），在瓷乳钵内充分研磨，加生理盐水10ml，制成悬液，给动物腹腔注射，剂量为豚鼠和地鼠1～2ml，仔兔和仔犬3ml。

③观察：试验动物接种后，每日测温和称重。第1周内可隔日采心血培养一次。如经过2周动物仍不发病，应先采心血作凝集溶解试验，然后宰杀取其肝、肾组织分别培养。如果被检血清凝集溶解试验呈阳性反应，可应用同样动物盲目传3代。

[1] 魏铁镇，姜丹，王猛，等.鹿钩端螺旋体病的诊断与防治[J].吉林畜牧兽医，2008，29（1）：20.

官福跃（1976—），女，本科学历，中级，主要从事动物畜牧兽医工作。