Toll样信号受体介导的脑出血后炎症反应

林　帅，薛维爽，田　力，石　权，陶　冶，滕伟禹

·综述·

Toll样信号受体介导的脑出血后炎症反应

林帅，薛维爽，田力，石权，陶冶，滕伟禹*

中国医科大学附属第一医院神经内科，沈阳 110001

[摘要]炎症机制对脑损伤和脑损伤后的潜在修复有重要的作用。脑出血后产生的各种刺激促进了炎症反应的进展。血肿组分通过激活小胶质细胞，从而释放促炎性细胞因子和趋化因子，以吸引病灶周围的炎性浸润。临床研究发现，炎症信号途径参与了小胶质细胞激活、白细胞浸润、Toll样受体的激活等。近年来对于Toll样受体的研究越来越多，有研究表明，Toll样受体介导的炎症通路在肿瘤、各种炎症性疾病、风湿免疫性疾病、糖尿病等疾病中发挥了重要的作用，此外，Toll样受体还参与中枢神经系统疾病的发病，如阿尔兹海默病、脑中风、多发性硬化等。了解Toll样受体与脑出血的关系，对基础研究和临床治疗方面越来越重要。

[关键词]脑出血；炎症；Toll样受体

0引言

从人们发现第一个Toll样受体(TLRs)起，对于TLRs的研究已持续将近20年。虽然目前TLRs在各种疾病中的作用机制尚未完全阐明，但是其在各种疾病中所发挥的作用仍不可忽视[1]。脑出血是神经科最常见的疾病之一，随着近年来人口老龄化，高血压人群的增多，我国(尤其在农村地区)脑出血的发病率呈现明显的上升趋势，脑出血后遗留的肢体瘫痪等严重降低了患者的生活质量。已有研究表明，TLRs介导的炎症反应参与了脑出血的继发性损伤，这一发现为脑出血的临床治疗提供了新的理念。在动物脑出血实验模型中，研究比较多的是TLR2和TLR4。众多实验表明，TLR2和TLR4的确在脑出血后炎症反应中发挥重要作用，其中还有很多因子及其他因素参与。在脑出血治疗方面，对于TLR2和TLR4拮抗剂的研究目前还处于临床前阶段。本文介绍了TLRs及其在脑出血后炎症反应中的作用，通过对其机制的探索，为脑出血的临床治疗提供新的思路与方法。

1TLRs

TLRs是一个保守的模式识别受体家族，是参与非特异性免疫(先天性免疫)的一类蛋白质分子，能够识别外源性病原相关模式分子(PAMPs)和内源性损伤危险相关模式分子(DAMPs)，在先天免疫系统中发挥重要作用。TLRs最初是在果蝇体内发现的，与人类白介素1-受体相似，有研究发现，果蝇体内的TLRs的确在果蝇的免疫系统中具有重要的功能，特别是在对抗真菌感染过程中。1997年，人们发现了人类体内的第1个与果蝇同源的TLR[2]。这一发现使我们对先天性免疫有了更新的认识。到目前为止，在人类中发现有功能的TLRs有10种，在老鼠中有12种，TLR1～9在人类及老鼠体内都存在。在老鼠体内TLR10是没有功能的，而TLR11、TLR12、TLR13不存在于人体内，在一项对不同TLRs缺陷的老鼠研究中发现，TLRs依据外源性病原相关模式分子(PAMPs)(包括细菌、酵母、病毒、真菌和寄生虫等)的不同而执行不同的功能，介导不同的免疫反应[3]。

1.1TLRs介导的炎症通路TLRs是Ⅰ类跨膜受体蛋白，包括细胞外富含19～25个重复亮氨酸结构域(LRR)以及细胞内Toll-白细胞介素1受体(TIR)结构域。胞外LRR在多种蛋白中存在，执行配体的识别和信号转导功能。胞内TIR由200多个氨基酸组成，在家族成员之间有高度保守的序列。细胞外结构域与配体相结合，细胞内结构域与接头蛋白相结合[4]。TLRs与内源性配体结合后，主要引发两个信号转导通路,其中一条通路依赖MyD88分子(髓样化分子88)途径(除TLR3外的所有TLRs)。另一条通路依赖TRIF途径。在依赖MyD88信号转导通路中，MyD88募集白介素-1受体相关激酶4(IRAK4)，并使IRAK1磷酸化。IRAK1和IRAK4脱离MyD88并与E3泛素连接酶-TRAF6相互作用，从而使自身及非经验性分子通道(NEMO)泛素化。后者引起一系列复杂的酶促反应，包括TAK1和TABs，TAK1及TABs激活IKK和MAPK途径，最终使NF-κB及AP-1(激活蛋白1)激活。在TRIF依赖性信号转导通路中，TRIF将直接与TRAF6和(或)RIP1结合，最终激活NF-κB[5]。NF-κB磷酸化JNK和p38，并运送到细胞核。在细胞核JNK和p38的磷酸化激活c-fos和c-jun基因。c-fos和c-jun形成同源或异源二聚体通过亮氨酸拉链结构域，从而进一步形成转录因子AP-1。AP-1介导TNF-α、IL-6和Fas基因的转录，调节巨噬细胞分化，并上调TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12。白细胞介素自分泌刺激TLR7，启动STAT3信号通路，通过它激活B细胞[6]。TLRs被触发后引起NF-κB激活，控制许多基因参与先天性免疫和适应性免疫、各种细胞的生存及增殖、细胞的应激反应、抗细胞凋亡和肿瘤进展。

TLRs不仅识别外源性病原相关模式分子(PAMPs)，也可识别内源性损伤危险相关模式分子(DAMPs)，DAMPs为TLRs的配体，包括热休克蛋白60(HSP60)和纤维蛋白原以及神经节苷脂和透明质酸片段。这些分子大多数来自细胞外基质或受损伤细胞的释放，暴露于TLRs，引起炎症性疾病。这种机制可能促进感染性以及非感染性中枢神经系统的损伤[7]。

1.2TLRs在中枢神经系统中的表达所有中枢神经系统中的细胞均表达TLRs,而每种类型的细胞表达的TLRs都不尽相同，这与它们的信号接头蛋白相关[8]。TLRs在中枢神经系统中，主要分布在小胶质细胞，脑室周围脑组织以及脑膜这些与外界频繁沟通的区域。这种独特的分布方式可使中枢神经系统快速识别从中枢神经系统外入侵到中枢神经系统的病原体。在静息状态下，通过PCR技术，在啮齿动物的中枢神经系统内检测到了TLR1～9。在中枢神经系统中主要研究TLRs在小胶质细胞及星形胶质细胞中的表达。小胶质细胞可以表达几乎所有的TLRs家族成员，星形胶质细胞也可以表达多种受体，但较小胶质细胞少，到目前为止，在人类星形胶质细胞检测到的TLRs有TLR1～5和TLR9，表明星形胶质细胞可能在中枢神经系统病毒感染中起重要作用。在正常的情况下，小胶质细胞和星形胶质细胞表面几乎没有TLRs的表达，而一旦有炎症损伤出现，就可在其表面检测到较低水平的TLRs，说明在中枢神经系统中TLRs表达可随着细菌或病毒感染，中枢神经系统自身免疫性疾病，或TLRs激动剂的应用而上调。Daniela等[9]表明，TLRs在中枢神经系统的稳态中起重要作用。TLRs在中枢神经系统中的表达具有动态变化，其中一些TLRs只出现在特定环境中某种类型的细胞中，这表明它们参与并在中枢神经系统的生理和病理状态中执行功能。在感染、炎症以及其他TLRs被激活的情况下，中枢神经系统中TLRs的表达明显上调。TLRs及相关信号通路在多种中枢神经系统疾病，如感染、中风、经典的神经退行性疾病、多发性硬化等中起重要的作用。TLRs在小胶质细胞中的激活，主要在大脑的先天性免疫系统中，可引起神经毒性分子的分泌如细胞因子和活性氧的释放。在中枢神经系统生理或病理的情况下，会有多个TLRs的配体同时存在，多种TLRs同时激活，各种TLRs及其复合物可能会触发特定的细胞内信号通路，从而引起中枢神经系统的炎症反应[10]。

2TLRs介导的脑出血后的炎症反应

2.1脑出血后的炎症反应脑出血约占所有脑卒中的15%～20%，死亡率高达30%～50%，每年每十万人中就有24.6个人发病。随着人口的老龄化以及临床上抗凝药物的应用，预测到2050年，脑出血的发病率会增加1倍。在脑出血发病前几个小时造成的损伤主要来源于脑血肿对周围脑组织的压迫，许多患者在没有血肿继续扩大的情况下，病情逐渐恶化，说明脑出血后继发的中枢神经系统损伤起关键性的作用。脑出血的继发性损伤包括炎症反应、脑水肿、细胞凋亡，最终血脑屏障破坏，使大量脑细胞死亡。血脑屏障之外的炎症反应是机体对外界的防御反应，经典的炎症反应过程包括发红、肿胀、发热、疼痛和功能丧失。在炎症反应过程中白细胞向局部浸润和迁移，释放各种炎性介质，这些介质通过各种受体介导炎症损伤。炎症反应也是脑出血后的防御反应，炎症机制在脑出血的继发性损伤中发挥重要的作用。通过对中枢神经系统炎症途径的了解，已发现了新的分子治疗靶点，相应的治疗策略已在临床前脑出血模型中进行了测试。

脑出血时病变的血管发生破裂，血液渗入周围脑组织，从而形成血肿。血肿成分导致小胶质细胞活化、炎性细胞渗入及细胞因子和炎症趋化因子的释放，进而导致细胞死亡和脑损伤[11]。

脑出血后的炎症反应涉及小胶质细胞的激活，星形胶质细胞的活化，脑水肿的形成，白细胞向炎症部位的积聚以诱导炎症反应和潜在毒性物质释放。小胶质细胞和星形胶质细胞作为中枢神经系统的“监护人”，被认为是脑出血后炎症反应中的早期炎性细胞。小胶质细胞的激活导致多种炎性细胞浸润，包括白细胞、巨噬细胞、T细胞等。随后，激活的炎症细胞释放各种细胞因子、趋化因子、自由基和其他潜在的有毒化学物质。红细胞裂解发生在脑出血约24 h后，此时更多的细胞毒性物质，如血红蛋白、血红素和铁的释放，进一步加重脑损伤。随着脑出血的进展，死亡的神经元细胞释放各种各样的“危险信号”激活免疫系统[12]。这些“危险信号”被称为内源性损伤危险相关模式分子(DAMPs)，包括ATP、神经递质、核酸、热休克蛋白，这些刺激作用于不同的细胞受体，包括TLRs和晚期糖基化终产物受体，几种TLRs包括TLR4参与了脑出血的炎症反应过程[13]。

2.2TLRs介导脑出血后炎症反应目前，在脑出血后TLRs介导的炎症损伤中，研究较多的是TLR4和TLR2。Manuel等[14]发现，TLR2及TLR4在单核细胞和嗜中性粒细胞中表达，TLR2与TLR4表达增加与脑出血后3个月内的功能缺失有关。并发现在单核细胞及中性粒细胞中，TLRs表达随着时间的推移有减少的趋势，而嗜中性粒细胞中的TLR2不会减少。TLRs表达增加的越多临床预后越差。也有证据表明，TLRs促进神经元死亡、血脑屏障破坏及缺血性脑卒中的炎症反应。

2.2.1TLR2在脑出血后炎症反应中的作用最近研究表明，TLR2参与各种神经性疾病的先天性免疫反应，其具体机制及具体功能目前尚没有明确阐明。TLR2是Ⅰ类跨膜受体，可以识别脂磷壁酸(LTA)、细菌细胞壁的肽聚糖，从而介导先天性免疫炎症反应。TLR2主要在小胶质细胞中表达，星形胶质细胞表达TLRs的数目有限，DAMPs包括热休克蛋白、HGMB-1、载脂蛋白CⅢ等可以激活TLR2。也有研究显示，在接受PAMPs刺激的大鼠的中枢神经系统中，TLR2在星形胶质细胞表达明显上调。

一项免疫印迹分析显示，在小胶质细胞处理全血裂解液及红细胞裂解液时，TLR2的表达上调，提示红细胞裂解液中的成分与TLR2的表达上调有关。当用小胶质细胞分别处理红细胞及红细胞产物时，发现只有血红蛋白能显著提高TLR2的表达。TLR2通过MyD88依赖途径启动下游信号转导，从而引发炎症反应[15]。

Gina等[16]在大鼠缺血性脑卒中的实验中发现，应用单克隆抗TLR2抗体的大鼠体内，脑梗死后脑水肿以及炎症反应在48 h明显减轻，这说明TLR2在介导缺血性脑卒中后继发性神经损伤和炎症反应中起重要作用。在另一项动物实验模型中，向大鼠的脑实质中注入胶原酶，通过降解细胞外基质和破坏血脑屏障诱导脑出血[17]。研究显示，TLR2介导的炎症损伤在大脑细胞中发生，与白细胞无关，与血脑屏障的破坏及星形胶质细胞中MMP9(基质金属蛋白酶-9)的激活有关。MMP9是细胞外蛋白酶，在胚胎的发育、血管的生成、排卵、组织修复中起重要作用。人类体内发现的MMP9有23种，最初由Rosenberg等[18]研究发现，在大鼠脑出血24 h之内，其体内的MMP9的表达明显上升，MMP9可以降解多种基质，MMP9无限制的表达可引起组织损伤和炎症反应。在中枢神经系统中，MMPs参与神经退行性病变如多发性硬化、阿尔兹海默病等[19]。在缺血性脑卒中，MMP9在内皮细胞、星形胶质细胞和神经元中表达，通过TLR4介导炎症反应。某些TLR2激动剂(如血红蛋白)通过TLR2途径激活星形胶质细胞中的MMP9，破坏血脑屏障，加剧了脑出血后的继发性损伤。

2.2.2TLR4在脑出血后炎症反应中的作用TLR4是最早在哺乳动物体内发现的与果蝇同源的TLRs，是革兰阴性菌细胞壁成分脂多糖(LPS)的主要受体，能识别病毒蛋白。有研究表明，TLR4在多种神经系统疾病中发挥重要作用，包括帕金森病、阿尔兹海默病、多发性硬化、ALS[20]。在脑出血情况下，TLR4被一系列内源性蛋白激活，如血红素、纤维蛋白原、热休克蛋白70、透明质酸、HMGB-1等。在大鼠的脑出血模型实验中，TLR4在大鼠脑出血后6 h开始上升，第3天达到高峰，在第5天有所下降，而在第7天时仍能保持基线水平[21]。在缺血性脑卒中的模型中，TLR4敲除的大鼠体内一氧化氮合酶及MMP9的表达均较正常大鼠低[22]，由此可知，TLR4在中枢神经系统的炎症反应过程中起重要作用。Sangsing等[23]试验模拟了自发性大鼠纹状体出血，在人体内，这种脑出血是高血压导致的最常见的脑出血类型。研究发现，在TLR4敲除的大鼠体内，在脑出血部位周围的白细胞、单核细胞、中性粒细胞的聚集较正常野生型大鼠少。3 d后，脑出血水肿周围的炎症反应较野生型大鼠轻。表明TLR4参与了脑出血后继发性炎症反应。Sangsing的实验模型的另一项重要发现是，血液中的TLR4而不是神经系统表达的TLR4可能在脑出血后炎症反应中起关键作用。这表明脑出血后，血肿成分中的血小板、中性粒细胞等可能是通过血凝块内的纤维蛋白原或纤维蛋白激活TLR4，促进了炎症的发展并影响脑出血患者的预后。此实验中还指出，相比于TLR4敲除的大鼠，在野生型大鼠脑出血模型中，CX3CL1趋化因子(可趋化中性粒细胞、单核细胞、T细胞等)、CSF2(造血生长因子)、CD36的表达均增加。脑出血后，血红蛋白的释放激活了TLR4，体外研究表明，血红素可使小胶质细胞TLR4表达上调，而铁不能。随着血红素的释放，活化的小胶质细胞表达TNF-α增加。血红素激活小胶质细胞，可通过TLR4释放炎症因子。TLR4通过MyD88和TRIF途径介导炎症反应[24]。

虽然TLR4均参与脑缺血和脑出血的炎症反应过程，但在脑出血和脑缺血过程中，TLR4介导的信号通路是不同的。TLR4介导的脑出血后炎症反应有MyD88和TRIF途径参与，而TLR4介导的脑缺血后炎症反应只通过MyD88依赖途径。在MyD88依赖性途径中，TLR4不仅激活NF-κB途径，也激活AP-1途径。AP-1是一种聚体蛋白，包括Jun、Fos蛋白和α-甲胎蛋白家族。AP-1活化导致多种炎症介质的表达，如MMPs、蛋白酶和细胞因子如IL-1和IFN。AP-1在脑出血中的作用尚未明确，AP-1活化TLR4信号主要是通过MAPK介导的，包括JNK、P38和ERK[25]。

TLRs家族在先天性免疫和获得性免疫中发挥重要的作用。TLRs通过识别不同的接头蛋白，不同的信号途径介导不同的免疫反应。目前从动物实验到临床实验，TLRs被应用在不同的实验设置当中，包括对心脏疾病、肺部疾病及癌症的研究。这使我们进一步了解机体对外源性危险分子以及机体自身产生的炎症因子等的识别和抵御机制。TLRs在中枢神经系统中的研究还很少，关于TLRs在脑出血后炎症损伤中作用机制的研究，为脑出血的临床治疗提供了新的思路。我们可通过TLRs介导的错综复杂的信号途径，寻找治疗脑出血后炎症反应的新理论。例如可通过应用TLR拮抗剂、TLR的特异性结合配体等阻止TLRs信号转导通路，如TLR2的拮抗剂OPN-305，OPN-305是TLR2的单克隆抗体，能抑制TLR2介导的前炎症因子表达；TLR4的拮抗剂Eritroan，能抑制TLR4的激活。目前对TLR2以及TLR4拮抗剂的研究仍处于临床前阶段。随着研究的不断进展，对TLRs研究的不断深入，TLRs拮抗剂的应用有望减轻脑出血后的炎症反应造成的继发性损伤，从而改善脑出血患者的预后，提高患者的生活质量。

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Inflammatory reaction mediated by Toll-like receptors after cerebral hemorrhage

LIN Shuai,XUE Wei-shuang,TIAN Li,SHI Quan,TAO Ye,TENG Wei-yu*

(Department of Neurology,the First Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)

[Abstract]ObjectiveThe mechanism of inflammation plays an important role in the brain injury and potential repairment after brain injury.Various stimulations produced by cerebral hemorrhage promote the progress of inflammation.The compositions of hematoma attract the inflammatory infiltration around the focus by activating microglia,which release pro-inflammatory cytokines and chemokines.Clinical studies have found that inflammatory signaling pathway is involved in the activation of microglia,leukocyte infiltration and activation of Toll-like receptors,etc.In recent years,more and more studies on Toll-like receptors have been done.Some studies have indicated that inflammatory pathways mediated by Toll-like receptors play an important role in tumors,various inflammatory diseases,rheumatic diseases,and diabetes mellitus,etc.In addition,Toll-like receptors are also involved in central nervous system diseases,such as Alzheimer′s disease,stroke,multiple sclerosis,ect.Understanding the relationship between Toll-like receptors and cerebral hemorrhage has become more and more important in fundamental research and clinical treatment.

Key words：Cerebral hemorrhage;Inflammation;Toll-like receptors

收稿日期：2015-10-31

基金项目：沈阳市科技技划项目(F16-206-9-03)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605028