Wnt信号通路对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的作用研究进展

吴　朗,黄　成,杨建东

(扬州大学医学院,江苏 扬州,225000)



Wnt信号通路对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的作用研究进展

吴朗,黄成,杨建东

(扬州大学医学院,江苏 扬州,225000)

关键词:骨髓间充质干细胞; 细胞分化; 神经细胞

骨髓间充质干细胞为源于胚胎中胚层的早期细胞[1],其来源丰富，易于分离纯化，且具有多向分化潜能、低免疫排斥反应等特点。近年来，在组织工程、细胞移植治疗脑、脊髓损伤领域取得令人鼓舞的成就。研究发现，BMSCs于移植区域分化为神经样细胞是治疗脑、脊髓损伤的重要因素，但目前对该细胞神经分化机制尚无统一认识。另有研究[2]报道Wnt信号通路为细胞增殖分化的关键调控环节，可促进神经干细胞的增殖，有助于各类神经元的分化以及促进神经元极性建立和轴突生长[3]，这表明Wnt 信号系统在促进神经元的增殖和分化等生物学功能中起着重要的作用，已有研究发现其各组分在BMSCs 中均有表达，但目前对Wnt参与诱导BMSCs 分化为神经样细胞的分子机制了解不多，本文从骨髓间充质干细胞神经分化和信号通路两方面进行综述，以期为拓展BMSCs研究、应用领域供理论依据。

1骨髓间充质干细胞生物学特点

骨髓间充质干细胞是一类具有多向分化潜能和自我更新能力的干细胞。其含量很低，约占骨髓有核细胞的0.001%～0.01%[4]，故需对其进行体外分离、培养才能实现它的利用价值。目前获得BMSCs的方法主要有:全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法以及免疫磁珠分选法[5]。杨丽等[6]发现全骨髓贴壁培养法较密度梯度离心法操作简单且细胞贴壁时间短、增殖快、数量多。体外培养的BMSCs呈梭形或多角形，多呈“漩涡状”生长。与其它细胞一样，在体外培养条件下骨髓间充质干细胞经历生长滞缓期、对数增殖期以及生长平台期。研究[7]报道，体外培养的骨髓间充质细胞大多数处于G0/G1期，而复制活跃的细胞仅占10%，高比例的G0/G1期细胞暗示着BMSCs具有高度的分化潜能。

目前，尚未发现BMSCs的特异性的抗原表型，它主要表达一些非特异性的表面标志如CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、CD146+以及少量的MHC-Ι类分子，不表达CD11b、CD14、CD45、CD34[8]。正是MHC-Ι类分子的低表达、MHC-II类分子和共刺激分子(如CD40、CD80)的缺乏促成了BMSCs的低免疫原性[9]，不易引起免疫排斥反应。对于BMSCs的鉴定，多数学者[10]认为应采用逆向推断的方法，即根据细胞形态学、增殖能力、表面标志和多向分化的特点来判断。

2Wnt信号通路概述

Wnt一词是wingless和Int-1的合称[11]。20世纪80年代,Nusse等在研究鼠乳腺癌的过程了发现了小鼠的原癌基因Int-1,随后发现Int-1和果蝇的无翅基因Wingless有高度的同源性，故将二者合并为Wnt。Wnt基因编码一类分泌型糖蛋白，含一段疏水的信号肽和23或24个保守位置的半胱氨酸残端，通过自分泌或旁分泌发挥作用。

Frizzled(Fzd)蛋白是Wnt蛋白的受体，为七次跨膜蛋白，结构上类似于G蛋白偶联受体。Fzd的胞外区有一个富含半胱氨酸的结构域(CRD),能与Wnt配体结合。不同的Fzd受体与相应的Wnt蛋白结合可以激活不同的下游信号途径，包括经典的Wnt/β-catenin途径及非经典途径[12]。Wnt信号通路中另外一种重要的受体是脂蛋白受体相关蛋白(LRP5/6),它位于成骨细胞膜Fzd受体和Kremen受体之间。

Wnt信号通路包括经典的Wnt/β-catenin通路和非经典通路，其中非经典通路包括Wnt/Ca2+、Wnt/PCP、Wnt/c-Jun和Wnt/Rho通路[13]。在经典Wnt/β-catenin通路中，β-联蛋白(β-catenin)起到关键的作用。在正常情况下，部分β-catenin与细胞膜上的钙黏附蛋白结合，其余的β-catenin与结肠腺瘤样息肉蛋白(APc)、轴素多聚蛋白(axin)复合物结合。而糖原合成酶激酶(GSK-3β)可以磷酸化与上述复合物结合的β-catenin，使之在泛素蛋白酶体系的作用下被降解，从而保持胞质内游离的β-catenin浓度处于较低的状态[14]。当经典Wnt信号通路活化时,Wnt蛋白与Fzd以及LRP5/6结合，激活胞内的散乱蛋白(Dishevelled，Dvl/Dsh)抑制GSK-3β的活性，引起β-catenin在胞内积累并结合核蛋白Nup62、Nup153、RanBP2进入胞核[15]，与T细胞因子以及淋巴样增强因子结合激活靶基因的转录和表达，Wntl、Wnt2a、Wnt3a、Wnt7a、Wnt8a、Wntl0b的信号传导多经过此通路，而非经典信号通路多由Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a、Wnt11激活。

3Wnt信号通路参与骨髓间充质干细胞增殖、分化

3.1Wnt信号通路与BMSCs增殖

研究表明,BMSCs具有很强的体外增殖能力。目前多认为Wnt信号通路对BMSCs的增殖起着双向调节的作用。Baksh D等[16]研究发现，Wnt3a能够促进BMSCss增殖，而Wnt5a则可通过激活非经典Wnt信号途径拮抗wnt3a,抑制BMSCs增殖。研究[17]认为，Wnt3a的这种促进增殖的作用可能与cyclinD1的上调以及c-myc的表达有关。虽然Wnt3a在单独作用的情况下可以促进其增殖，但联合不同诱导剂后却起着促分化作用。曹玉净等[18]用Western blot检测细胞增殖标记分子Ki67,发现下调BMSCs Wnt6基因后显著抑制Ki67的表达，而上调Wnt6基因后则显著促进Ki67的表达，这表明Wnt6能够促进BMSCs的增殖。Wnt信号通路可以在不同的水平上调控BMSCs的增殖，但其具体调控机制还有待进一步研究。

3.2Wnt信号通路对BMSCs向神经元样细胞分化的作用

Woodbury等[19]在体外用二甲基亚砜和丁基羟基茴香醚成功诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，并表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)，这表明BMSCs可以向神经元样细胞分化。目前，体外诱导BMSCs神经分化的方法众多，主要有细胞因子诱导法、细胞共培养诱导法、药物诱导法、核酸及其衍生物诱导法等，但对其诱导分化机制的研究甚少。大量研究表明，在BMSCs神经分化的过程中Wnt信号通路起重要的作用，现将其归纳如下。

β-catenin作为Wnt信号通路中关键的信号分子，在BMSCs的神经分化中也起到重要的作用。有研究[20]发现在诱导BMSCs分化后β-catenin含量升高，为了进一步确认Wnt/β-catenin在BMSCs神经分化中的作用，将β-catenin基因从骨髓间充质干细胞中敲除，诱导后发现NSE和巢蛋白(nestin)的表达都大幅下降。而加入Wnt3a诱导后NSE和nestin都明显升高。这一研究表明，Wnt/β-catenin信号通路可能在BMSCs的神经分化中起到关键的作用。阎文柱[21]等采用神经营养因子碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a诱导大鼠骨髓间充质干细胞体外分化，发现Wnt3a诱导前后巢蛋白均有表达，神经元特异性烯醇化酶在诱导后5天明显扩增，10天后更加明显，而Wnt5a诱导前后巢蛋白呈弱阳性表达，神经元特异性烯醇化酶呈阴性，这表明Wnt3a能够促进体外培养的BMSCs向神经元样细胞分化，而Wnt5a则没有这样的作用。

Tsai等[22]在用神经营养因子诱导BMSCs分化的研究中发现，Wnts可以通过经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路促进BMSCs向神经元样细胞分化。在诱导体系中加入Wnt7a后检测到突触标志物SYN1、BSN、SYTG以及胆碱能神经元标志物ChAT、多巴胺神经元标志物DBH表达均增加，并证明了Wnt7a对突触标志物的刺激是通过激活经典Wnt信号通路完成的。进一步用SP600125阻断JNK信号通路后，ChAT和DBH的表达完全受阻而MAP2和SYN1的表达不受影响，这表明Wnt7a通过非经典通路JNK来调控BMSCs分化的具体神经元类型。

骨髓间充质干细胞的研究仍有一些问题需要解决。首先，BMSCs的免疫标志物并不确定，目前采取的逆推法对其进行鉴定并不可靠。其次，体外诱导得到的神经细胞虽然可以通过一定的标志物来鉴定，但是其是否具有生理功能还需要进一步的研究验证。此外，BMSCs虽然具有多系分化的潜能，但是其分化的效率并不理想，定向分化的条件也不确定，如何高效获得神经细胞还需进一步探究。BMSCs具有来源广泛、取材简单、增殖能力强、易于在体外培养等优点，在适宜的条件下可以诱导分化为神经元样细胞并且移植后免疫排斥反应小，这使其在临床上治疗神经系统疾病有着很大的应用前景。相信随着BMSCs神经分化机制的深入研究，其临床应用将走上一个新台阶。

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收稿日期:2016-04-03

基金项目:江苏省六大人才高峰(2014-WSN-076); 扬州市“科教兴卫工程-学科技术带头人”;

通信作者:杨建东,E-mail:yangjiandong69@sohu.com

中图分类号:R 329

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)15-206-03

DOI:10.7619/jcmp.201615079

南通市青年医学人才科研基金资助项目(WQZ2015010)