从OPG-RANKL破骨细胞调控通路和Wnt成骨细胞调控通路探讨“肾主骨”的性别差异及其机制*

付小卫，宋长恒，张治国，于 峥，刘 红，潘静华，李 艳，王少君，汪文来，李岳泽，吴佳莹，赵宏艳，刘梅洁，鞠大宏△

(1．陕西中医药大学第二临床医学院，陕西咸阳 712046; 2．中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

从OPG-RANKL破骨细胞调控通路和Wnt成骨细胞调控通路探讨“肾主骨”的性别差异及其机制*

付小卫1，宋长恒2，张治国2，于 峥2，刘 红2，潘静华2，李 艳2，王少君2，汪文来2，李岳泽2，吴佳莹2，赵宏艳2，刘梅洁2，鞠大宏2△

(1．陕西中医药大学第二临床医学院，陕西咸阳 712046; 2．中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

目的:从OPG-RANKL破骨细胞调控通路和Wnt成骨细胞调控通路的角度，部分揭示“肾主骨”的性别差异及其机制。方法:选用同龄雌、雄SD大鼠160只，雌雄各半，共分为雌雄空白对照组、雌雄假手术组、OVX组、ORX组、E2组、T组、雌雄左归丸组、雌雄右归丸组12组，并采用卵巢切除和睾丸切除的方法制作肾虚OP动物模型。在去势后10 d，各给药组开始灌胃给予相应的药物，每天1次，连续6 d，休息1d后再连续给药6 d，如此给药3个月。给药结束后，将各组大鼠处死取双侧胫骨进行各项指标的检测。结果:左归丸对OVX大鼠OP具有明显疗效，而对ORX大鼠OP没有疗效;右归丸对OVX大鼠和ORX大鼠OP虽均有明显疗效，但对OVX大鼠的疗效要明显优于ORX大鼠。左归丸能使OVX大鼠骨髓中RANKL蛋白表达显著下调，而使OPG蛋白表达显著上调;同时使Wnt1和β-catenin蛋白表达显著下调，而左归丸对ORX大鼠的以上指标无明显影响。右归丸对OVX大鼠骨髓中OPG、RANKL以及Wnt1、β-catenin蛋白表达的作用与左归丸的相同，只是右归丸的作用强度要明显大于左归丸。右归丸能使ORX大鼠骨髓中RANKL以及Wnt1、β-catenin蛋白表达均显著下调，但对OPG蛋白表达无明显影响，并对RANKL、Wnt1和βcatenin的作用要明显弱于对OVX大鼠的作用。结论:“肾主骨”存在性别差异，OPG-RANKL破骨细胞调控通路和Wnt成骨细胞调控通路发生不同改变，是造成这种差异的机制之一。

肾主骨;OPG-RANKL破骨细胞调控通路;Wnt成骨细胞调控通路

“肾主骨”是中医的重要理论之一，是中医治疗骨质疏松症(OP)的主要理论基础。长期大量的临床实践表明，依据该理论进行遣方用药能取得较好的临床疗效。中医学认为，男女阴阳禀赋相异，生长壮老发展的各个阶段皆有不同，这就造成男女之间在生理和病理上存在明显差异。“肾主骨”是否也存在性别差异，若存在其机制如何?对此本实验采用卵巢切除(OVX)和睾丸切除(ORX)大鼠作为肾虚OP动物模型，从OPG-RANKL破骨细胞调控通路和Wnt成骨细胞调控通路的角度，探讨“肾主骨”的性别差异及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取9周龄SPF级SD大鼠160只，雌雄各半，雄鼠体质量250～270 g，雌鼠体质量200～220 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(许可证号SCXK(军)2007-004)，饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级实验动物室(实验动物使用许可证号SYXK (京)2010-0032)。

1.1.2 药物 左归丸药液由熟地24 g、山药12 g、枸杞子12 g、山萸肉12 g、川牛膝9 g、莬丝子12 g、龟板胶12 g、鹿角胶12 g组成，常规水煎制成浓度为0.968 g生药/ml的药液。右归丸药液由熟地24 g、山药12 g、山茱萸9 g、枸杞子9 g、鹿角胶12 g、菟丝子12 g、杜仲12 g、当归9 g、肉桂6 g、制附子6 g组成，常规水煎制成浓度为1.024 g生药/ml的药液。以上中药均经中国中医科学院中药研究所生药室鉴定。

戊酸雌二醇1 mg/片，拜耳医药保健有限公司广州分公司产品(批号234A)，临用时将其碾碎后用纯净水制成浓度为0.0092 mg/ml的混悬液。甲睾酮5 mg/片，上海信谊康捷药业有限公司产品(批号110801)，临用时将其碾碎后用纯净水制成浓度为0.092 mg/ml的混悬液。

1.1.3 主要试剂及仪器 大鼠骨保护素(OPG);细胞核因子-κB受体活化因子配基(RANKL);Wnt1和 β-catenin抗体，美国 SANTA CRUZ公司产品(批号 F1813、E1613、B0113、G1813);山羊超敏二步法检测试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司进口分装(批号K133312D)。

CRYOTOME FSE冰冻切片机，美国Thermo公司产品;Reicheit-Jung 2040切片机、DM6000 B显微镜、Qwin Pro V3.5.0图像分析系统，德国Leica公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 将160只同龄SD大鼠，根据性别按体质量分为6组，其中雌性空白对照组和雄性空白对照组各12只，雌性假手术组和雄性假手术组各12只，雌性造模组和雄性造模组各56只。按照文献［1］方法切除雌性造模组大鼠的双侧卵巢，按照文献［2］方法切除雄性造模组大鼠的双侧睾丸。雌性假手术组和雄性假手术组的手术过程同上，但不摘除卵巢或睾丸。以上雄性假手术组有1只、造模组雌、雄性大鼠因手术各有3只于当天死亡。

在术后10 d，再将两造模组大鼠以体质量按随机数字表法分为OVX组13只，ORX组14只，戊酸雌二醇组(E2组)14只，甲睾酮组(T组)13只，雌性左归丸组13只，雄性左归丸组13只，雌性右归丸组13只，雄性右归丸组13只共8组。分组后开始对各给药组大鼠灌胃给药，雌、雄左归丸组大鼠分别给予浓度为0.968 g生药/ml的左归丸药液，给药体积为1 ml/100 g体质量，给药剂量为9.68 g生药/kg体质量;雌、雄右归丸组大鼠给予浓度为1.024 g生药/ml的右归丸药液，给药体积为1 ml/100 g体质量，给药剂量为10.24 g生药/kg体质量;E2组大鼠给予浓度为0.0092 mg/ml的戊酸雌二醇药液，给药体积为1 ml/100 g体质量，给药剂量为0.092 mg/kg体质量;T组大鼠给予浓度为0.092 mg/ml的甲睾酮药液，给药体积为1 ml/100 g体质量，给药剂量为0.92 mg/kg体质量。以上各组给药剂量均为成人临床用量的6.5倍，雌雄空白对照组、雌雄假手术组、OVX组、ORX组大鼠按上法灌服等体积的纯净水。以上给药、给水每天1次，连续6 d，休息1 d后再连续给药6 d，如此给药3个月。每周称重1次，根据体质量调整给药量。在给药过程中，雌性右归丸组和雄性左归丸组各有1只大鼠因灌胃操作不慎死亡。

各组大鼠分别于处死前16 d和前3 d腹腔注射盐酸四环素(剂量为30 mg/kg体质量)，对骨组织进行荧光标记。给药结束后，将大鼠以45 mg/kg体质量剂量的戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，然后迅速处死取右侧胫骨，用4%多聚甲醛固定制作不脱钙骨切片，用于骨组织形态计量学指标的检测;取左侧胫骨制作脱钙骨冰冻切片，用于骨髓中 OPG、RANKL、Wnt1和β-Catenin蛋白表达的检测。

1.2.2 指标检测 1)骨组织形态计量学指标测定:取右侧胫骨塑料包埋，用2040切片机纵向切取5 μm不脱钙骨切片，共制作2张，一张用甲苯胺蓝染色，另一张则直接用于荧光观察。采用Qwin Pro V3.5.0图像分析系统，按照国际骨形态计量参数测量定义和计算标准，取大鼠胫骨骨骺线1 mm下，对不脱钙骨切片进行形态计量［3-4］。①静态参数。骨小梁体积百分比(TBV%):骨小梁体积占被测骨髓腔总体积的百分比，是反映骨量多少的重要指标;骨小梁吸收表面百分比(TRS%):不规则﹑凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，它可反映破骨细胞活性;骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨细胞被覆的类骨质表面占骨小梁表面的百分比，它可判断成骨细胞活性;骨丢失率= (某只大鼠胫骨TBV% －同性别空白对照组胫骨TBV%平均值)/同性别空白对照组胫骨TBV%平均值×100%。骨丢失率为正值时，表示骨量增加，绝对值越大表示骨量增加越多;为负值时，表示骨量丢失，绝对值越大表示骨量丢失越多。②动态参数。骨小梁矿化率(MAR):骨小梁表面四环素荧光双标记带平均距离/2次标记相隔的天数，反映骨小梁骨矿化速度;骨皮质矿化率(mAR):皮质内表面四环素荧光双标记带平均距离/2次标记相隔的天数，反映皮质骨矿化速度。

2)OPG、RANKL、Wnt1及－catenin蛋白表达的检测:取大鼠左侧胫骨近端1/3去除周围软组织，用4%多聚甲醛(0.01M PBS配制，pH 7.3，含1‰DEPC)固定;置于4℃冰箱48 h后，用0.01 M PBS (pH7.3，含1‰DEPC)充分洗涤骨组织，然后放入10%EDTA·Na20.01 M PBS(pH7.3，含1‰DEPC)中脱钙。置于4℃冰箱每天换液1次。脱钙结束后，用1‰DEPC水配制的0.01M PBS充分洗涤骨组织，随后浸入15%蔗糖，4℃冰箱保存。用冷冻切片机切取6 μm厚的纵向脱钙骨切片，贴于经1%多聚赖氨酸涂片的载玻片上，－20℃冰箱保存待测。

按照所附说明书采用免疫组织化学染色方法检测大鼠胫骨骨髓中OPG、RANKL、Wnt1及-catenin蛋白的表达。结果判断，骨髓中阳性反应细胞胞浆着色呈棕黄色。采用Qwin Pro V3.5.0图像分析系统进行检测，随机检测骨骺线1 mm下髓腔内5个以上高倍视野(×400)，计算每个视野的阳性面积比，取其平均值。阳性面积比为每个视野内胞浆着色呈棕黄色的阳性细胞面积占视野内骨髓腔面积的百分比，以其作为阳性反应细胞密度(简称阳性密度)。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差(±s)表示，若数据为正态分布则采用单因素方差分析;方差齐性组间两两比较采用 LSD检验，方差不齐采用Dunnett’s T3(3)检验。若数据呈非正态分布，则采用非参数检验Kruskal-Wallis单因素方差分析(k样本)(W)进行处理;组间两两比较，采用其项下的Stepwise step-down检验。

2 结果

2.1 左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨组织形态计量学指标的影响

2.1.1 左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨TBV%及骨丢失率的影响 表1显示，OVX组以及雌性各给药组大鼠胫骨TBV%均显著低于雌性假手术组;与OVX组比较，E2组、雌性左归丸组和右归丸组的 TBV%均显著增加;雌性右归丸组的TBV%明显高于雌性左归丸组。与此相应，OVX组以及雌性各给药组大鼠胫骨骨丢失率(绝对值，下同)较雌性假手术组均显著增加;与OVX组比较，E2组、雌性左归丸组和右归丸组的骨丢失率均显著减少;雌性右归丸组的骨丢失率较雌性左归丸组明显减少。与雄性假手术组比较，ORX组以及雄性各给药组的TBV%均显著减少;与ORX组比较，T组和雄性右归丸组的TBV%显著增加，而雄性左归丸组的无显著性变化，雄性右归丸组的TBV%显著高于雄性左归丸组。与此相应，与雄性假手术组比较，ORX组以及雄性各给药组的骨丢失率均显著增加;与ORX组比较，T组和雄性右归丸组的骨丢失率显著减少，而雄性左归丸组比较差异无统计学意义;雄性右归丸组的骨丢失率显著低于雄性左归丸组。ORX组的TBV%显著高于OVX组，其骨丢失率显著低于OVX组;雄性左归丸组与雌性左归丸组比较TBV%差异无统计学意义，但骨丢失率显著增加;雄性右归丸组与雌性右归丸组比较TBV%差异无统计学意义，但骨丢失率亦显著增加。

表1 各组大鼠胫骨TBV%和骨丢失率的变化

表2 各组大鼠胫骨TRS%、TFS%及其TRS/TFS变化比较

2.1.2 左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨TRS%、TFS%及TRS/TFS比值的影响

表2显示，与雌性假手术组比较，OVX组和雌性左归丸组的TRS%、TFS%及其TRS/TFS均显著增加，而E2组和雌性右归丸组比较差异无统计学意义;E2组、雌性左归丸组和右归丸组TRS%、TFS%及其TRS/TFS均显著低于OVX组;雌性右归丸组的以上3个指标较雌性左归丸组均明显减少。除T组外，ORX组、雄性左归丸组和右归丸组的TRS%、TFS%及其TRS/TFS较雄性假手术组均显著增加;与ORX组比较，T组、雄右归丸组的TRS%、TFS%及其TRS/TFS均显著减少，而雄性左归丸组无显著性变化;雄性右归丸组的以上3个指标均低于雄性左归丸组。ORX组的TRS%、TFS%及其TRS/TFS均明显低于OVX组;雄性左归丸组的TRS%、TFS%及其TRS/TFS均明显高于雌性左归丸组;雄性右归丸组以上3个指标均明显高于雌性右归丸组。

2.1.3 左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨MAR和mAR的影响 表3显示，OVX组、雌性左归丸组大鼠胫骨MAR及mAR较雌性假手术组均显著增加，E2组、雌性右归丸组比较差异无统计学意义;E2组、雌性左归丸组和右归丸组的 MAR及mAR均显著低于OVX组;雌性右归丸组的MAR及mAR较雌性左归丸组显著减少。ORX组、雄性左归丸组和右归丸组的MAR及mAR均高于雄性假手术组，而T组比较差异无统计学意义;与ORX组比较，除雄性左归丸组外，T组和雄性右归丸组的MAR及mAR均显著减少;雄性右归丸组的MAR及mAR低于雄性左归丸组。ORX组的MAR、mAR较OVX组显著减少;雄性左归丸组的MAR、mAR显著高于雌性左归丸组;雄性右归丸组显著高于雌性右归丸组。

表3 各组大鼠胫骨MAR及mAR的变化

图1 各组大鼠胫骨骨髓OPG蛋白表达阳性密度变化

图2 各组大鼠胫骨骨髓RANKL蛋白表达阳性密度变化

2.2 左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓中OPG、RANKL蛋白表达及其比值-RANKL/OPG的影响

2.2.1 左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓中OPG蛋白表达的影响 图1显示，与雌性假手术组、OVX组、雌性左归丸组大鼠胫骨骨髓中OPG蛋白表达阳性密度显著降低，而雌性右归丸组、E2组的阳性密度比较差异无统计学意义;与OVX组比较，E2组、雌性左归丸组和右归丸组的OPG蛋白表达阳性密度均显著增高;雌性右归丸组的OPG蛋白表达阳性密度明显高于雌性左归丸组。除T组外，ORX组、雄性左归丸组和右归丸组的OPG蛋白表达阳性密度均低于雄性假手术组;与ORX组比较，T组的OPG蛋白表达阳性密度显著增高，而雄性左归丸组和右归丸组比较差异无统计学意义;雄性右归丸组与雄性左归丸组比较OPG蛋白表达阳性密度差异无统计学意义。ORX组的OPG蛋白表达阳性密度明显高于OVX组;雄性左归丸组明显低于雌性左归丸组，雄性右归丸组明显低于雌性右归丸组。

2.2.2 左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓中RANKL蛋白表达以及RANKL/OPG比值的影响 图2、3显示，OVX组和雌性左归丸组大鼠胫骨骨髓中RANKL蛋白表达阳性密度以及RANKL/ OPG比值较雌性假手术组均显著升高，而E2组和雌性右归丸组比较差异无统计学意义;E2组、雌性左归丸组和右归丸组RANKL蛋白表达阳性密度以及RANKL/OPG比值均显著低于OVX组;雌性右归丸组较雌性左归丸组明显降低。与雄性假手术组比较，ORX组、雄性左归丸组和右归丸组RANKL蛋白表达阳性密度以及RANKL/OPG比值均显著升高，而T组比较差异无统计学意义;与ORX组比较，T组和雄性右归丸组RANKL蛋白表达阳性密度以及RANKL/OPG比值显著下降，而雄性左归丸组比较差异无统计学意义;雄性右归丸组明显低于雄性左归丸组。ORX组的RANKL蛋白表达阳性密度以及RANKL/OPG比值较OVX组明显降低;雄性左归丸组较雌性左归丸组明显增高，雄性右归丸组较雌性右归丸组也明显增高。

图3 各组大鼠胫骨骨髓RANKL/OPG比值的变化

2.3 左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓中Wnt1和-catenin蛋白表达的影响

2.3.1 左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓中Wnt1蛋白表达的影响 图4显示，与雌性假手术组比较，OVX组、雌性左归丸组大鼠胫骨骨髓中Wnt1蛋白表达阳性密度显著增高，而E2组、雌性右归丸组比较差异无统计学意义;E2组、雌性左归丸组和右归丸组的Wnt1蛋白表达阳性密度均显著低于OVX组;雌性右归丸组明显低于雌性左归丸组。ORX组、雄性左归丸组和右归丸组Wnt1蛋白表达阳性密度均显著高于雄性假手术组，而T组比较差异无统计学意义;T组、雄性右归丸组Wnt1蛋白表达阳性密度较ORX组显著降低，而雄性左归丸组比较差异无统计学意义;雄性右归丸组较雄性左归丸组显著降低。雄性左归丸组与雌性左归丸组、雄性右归丸组与雌性右归丸组比较，Wnt1蛋白表达阳性密度均明显增高，ORX组显著低于OVX组。

图4 各组大鼠胫骨骨髓Wnt1蛋白表达阳性密度变化

2.3.2 左、右归丸对不同性别去势大鼠胫骨骨髓-catenin蛋白表达的影响图5显示，OVX组和雌性左归丸组大鼠胫骨骨髓中-catenin蛋白表达阳性密度较雌性假手术组显著增高，而E2组和雌性右归丸组比较差异无统计学意义;E2组、雌性左归丸组和右归丸组-catenin蛋白表达阳性密度较OVX组均显著降低;雌性右归丸组明显低于雌性左归丸组。与雄性假手术组比较，ORX组、雄性左归丸组和右归丸组-catenin蛋白表达阳性密度皆显著增高，而T组比较差异无统计学意义;与ORX组比较，T组和雄性右归丸组-catenin蛋白表达阳性密度显著降低，而雄性左归丸组比较差异无统计学意义。ORX组-catenin蛋白表达阳性密度显著低于OVX组，雄性左归丸组明显高于雌性左归丸组，雄性右归丸组明显高于雌性右归丸组。

图5 各组大鼠胫骨骨髓-catenin蛋白表达阳性密度变化

雌、雄假手术组与其各自空白对照组比较，上述指标均未发生显著性变化，从而排除了手术因素对实验的影响。

3 讨论

本实验结果显示，OVX组和ORX组大鼠胫骨TBV%均显著低于各自的假手术组，与之相应，两者的骨丢失率均显著高于各自的假手术组;ORX组的TBV%显著高于OVX组，骨丢失率则显著低于OVX组。这一结果说明，去势均可造成骨量丢失并发生OP;但雌性大鼠丢失的骨量要明显多于同龄的雄性大鼠，表明去势所导致的骨量丢失存在着性别差异。

本实验结果进一步显示，在OVX组和ORX组TBV%较各自假手术组减少的同时，两者反映骨吸收的指标TRS%、TRS/TFS以及反映骨形成的指标TFS%、MAR、mAR均显著增加。这一结果表明，OVX和ORX所造成的均是高转换型的OP，即骨吸收与骨形成均增加，但由于骨吸收大于骨形成，而导致骨量丢失发生OP。骨形成是以骨吸收为前提的，去势所导致的骨形成增加是一种代偿性增加，如果骨吸收得到了抑制，骨形成也就随之降低。不同性别大鼠去势虽均可导致高转换型的OP，但也存在着性别差异，表现在ORX组的TRS%、TRS/TFS以及TFS%、MAR、mAR均显明低于OVX组，其中TRS/ TFS能反映骨转换的程度，代表骨转换率。这表明ORX所造成的高转换程度要明显低于OVX所造成的程度，即两者在高转换程度上存在性别差异。

OPG-RANKL-RANK是调控破骨细胞(OC)分化和功能的重要通路［5］。各种骨吸收刺激因子作用于成骨细胞(OB)和骨髓基质细胞(MSC)，使其表达RANKL，RANKL与OC前体细胞和OC表面上的RANK结合，从而促进OC的分化、成熟和激活，引起骨吸收;而OB和MSC又可分泌OPG，其与RANK竞争性结合RANKL，阻止RANKL与RANK之间的结合，抑制OC的分化、成熟，从而防止骨的过度吸收［6-8］。由此可以看出，RANKL与OPG共同调控着OC的功能，使之发挥正常功能;若两者发生异常改变，就可能使OC的功能发生异常。本实验结果显示，与各自的假手术组比较，OVX组和ORX组大鼠胫骨骨髓中RANKL蛋白表达阳性密度均显著增高，而OPG蛋白表达阳性密度均显著降低，两者的比值-RANKL/OPG均显著增加。与OVX组比较，ORX组的RANKL蛋白表达阳性密度明显降低，OPG蛋白表达阳性密度明显增高，RANKL/OPG明显降低。这一结果表明，OVX和ORX均可使RANKL蛋白表达上调，而使OPG蛋白表达下调。这是它们均可导致OP发生的共同机制之一，但也存在着性别差异，表现在ORX所造成的RANKL蛋白表达上调以及OPG蛋白表达下调的程度均不如OVX所造成的程度。这就是为什么雌性大鼠丢失骨量要明显多于同龄雄性大鼠的原因之一。

Wnt信号途径是细胞发育和调节生长的一个关键途径，在OB的定向分化、发育、增殖中起着关键性作用，是非常重要的骨代谢调控通路［9］。Wnt1和-catenin是其中的关键因子，它们表达增强可促进OB的定向分化、发育和增殖。本实验结果显示，OVX组和 ORX组大鼠胫骨骨髓中 Wnt1和 -catenin阳性密度均显著高于各自的假手术组;而ORX组Wnt1和-catenin阳性密度均低于OVX组。这一结果表明，OVX和ORX均可导致 Wnt1/-catenin OB调控通路功能上调，使骨形成增加，但ORX所造成的上调幅度要低于OVX所造成的幅度。这是OVX和ORX均可导致骨形成增加的共同机制之一，但也存在着性别差异，即ORX增加的程度要低于OVX增加的程度。

本实验结果显示，与OVX组比较，雌性左归丸组和雌性右归丸组大鼠胫骨TBV%均显著增加，骨丢失率均显著减少，同时大鼠胫骨TRS%、TRS/TFS以及TFS%、MAR、mAR均显著减少，雌性右归丸组与雌性左归丸组比较，TBV%明显增加，骨丢失率显著减少，而TRS%、TRS/TFS以及TFS%、MAR、mAR均显著减少。以上结果表明，左、右归丸均能抑制OVX所致骨的高转换，使骨吸收和骨形成均降低并提高骨量，而对OP均具有治疗作用;但右归丸的疗效要明显优于左归丸。对于ORX所致OP大鼠，右归丸对上述指标也能产生同样的效应，进而达到治疗作用;但左归丸无此效应，因而也就无治疗作用。本实验结果显示，与雌性左归丸组比较，雄性左归丸组的骨丢失率、TRS%、TRS/TFS以及TFS%、MAR、mAR均显著增加;与雌性右归丸组比较，雄性右归丸组的以上指标也出现相同结果。这一结果表明，左归丸、右归丸在治疗OP方面存在性别差异，表现在左归丸对OVX大鼠OP具有明显的治疗作用，而对ORX大鼠OP无治疗作用;右归丸对OVX大鼠OP和ORX大鼠OP虽均有治疗作用，但对前者的疗效要明显优于对后者的疗效。

中医理论认为“肾主骨”，肾精充实，骨髓化生有源，骨得其养则坚固有力;若肾精亏虚，骨髓化生乏源，骨失其养，就会出现骨脆易折、腰背疼痛等症状，即是现代医学所说的OP。因此，“补肾”是治疗OP的基本法则。左归丸与右归丸出自古代著名医家张景岳的《景岳全书》。左归丸具有滋补肾阴的功效，右归丸具有温补肾阳的功效。OVX和ORX所造成的是肾虚OP模型。基于以上认识，本实验结果同时说明，“肾主骨”存在着性别差异。

本实验结果显示，与OVX组比较，雌性左归丸组和右归丸组大鼠胫骨骨髓中的OPG蛋白表达阳性密度均显著增高，而RANKL蛋白表达阳性密度、RANKL/OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表达阳性密度均显著降低;雌性右归丸组的OPG蛋白表达阳性密度明显高于雌性左归丸组，而RANKL蛋白表达阳性密度、RANKL/OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表达阳性密度均低于雌性左归丸组。这一结果说明，左、右归丸均可通过对OPG-RANKL破骨细胞调控通路以及Wnt成骨细胞调控通路的调节而达到治疗OVX大鼠OP的作用。表现在使OPG蛋白表达上调，使RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表达下调，从而使骨吸收与骨形成均降低，抑制骨的高转换，使骨吸收与骨形成达到相对平衡状态，从而防止骨量的丢失。这是左、右归丸均能治疗OVX大鼠OP的共同机理之一，所不同的是右归丸对上述指标的作用强度要大于左归丸。这也是右归丸对OVX大鼠OP治疗效果优于左归丸的机理之一。

与ORX组比较，雄性左归丸组和右归丸组的OPG蛋白表达阳性密度差异无统计学意义;但雄性右归丸组的RANKL蛋白表达阳性密度、RANKL/ OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表达阳性密度均显著降低，而雄性左归丸组以上指标均无显著性变化。与雄性左归丸组比较，雄性右归丸组OPG的蛋白表达阳性密度无显著性变化，但RANKL蛋白表达阳性密度、RANKL/OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表达阳性密度均显著降低。这一结果说明，右归丸对ORX大鼠骨髓中的OPG虽无明显作用，但可通过下调RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表达来达到治疗OP的作用。左归丸对以上指标均未产生明显影响，所以对ORX大鼠OP无治疗作用。

与雌性右归丸组比较，雄性右归丸组的OPG蛋白表达阳性密度降低，而RANKL蛋白表达阳性密度、RANKL/OPG比值以及Wnt1和-catenin蛋白表达阳性密度均显著增高;与雌性左归丸组比较，雄性左归丸组的以上指标也发生同样的变化。通过这一结果，并结合同性别组间比较结果可以得到以下结论:右归丸对OVX大鼠OP的治疗效果之所以优于其对ORX大鼠的治疗效果，是由于以下两个原因:①右归丸不仅能使OVX大鼠骨髓中OPG蛋白表达上调，而且还能使RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表达下调，而右归丸对ORX大鼠骨髓中OPG蛋白表达无明显影响，而只能使RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表达下调;②右归丸虽均能使OVX大鼠和ORX大鼠骨髓中的RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表达下调，但对前者的作用强度要明显大于对于后者。左归丸能使OVX大鼠骨髓中OPG蛋白表达上调，而使RANKL、Wnt1和-catenin蛋白表达下调，而对ORX大鼠骨髓中的这些指标均未产生明显影响，所以左归丸对OVX大鼠OP有效，而对ORX大鼠OP无效。

综上所述，“肾主骨”存在性别差异，OPGRANKL破骨细胞调控通路和Wnt成骨细胞调控通路发生不同改变，是造成这种差异的机制之一。

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表2 各组大鼠血清、BALF中IL-4水平变化(±s)

表2 各组大鼠血清、BALF中IL-4水平变化(±s)

注:与空白组比较:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;与模型组比较:●P＜0.05，●●P＜0.01

组别 鼠数 IL-4(ng/L)血清BALF空白组模型组罗 氟 司 特 组苏 子 降 气 组QZZF小 剂 量 组QZZF中 剂 量 组QZZF大 剂 量 组10 10 10 10 10 10 10 3.62±0.18 4.71±1.19▲▲3.60±0.31●●3.53±0.61●●4.12±0.94●3.94±0.51●●4.02±0.37●3.46±0.20 3.84±0.58▲3.57±0.22 3.48±0.17●3.68±0.20 3.48±0.16●●3.66±0.14

中医学虽无“慢性阻塞性肺疾病”的病名，根据临床表现及发病特点，多属于“咳嗽”“痰饮”“肺胀”等范畴，其病理特征为本虚标实，正气虚弱为本，痰饮、血瘀、气滞等为标。芪蛭皱肺颗粒是我们基于COPD的病机特点所拟定的治疗方剂，具有益气培元、活血化瘀、瘪皱肺胀之功用。本实验结果表明，芪蛭皱肺颗粒能够降低COPD模型大鼠血清及BALF中 IL-4表达，升高动脉血气中 pH、PaO2、SaO2，降低PaCO2含量，并可能存在一定的量效关系。表明通过调节血清及BALF中IL-4表达水平，减轻气道炎症浸润，可能是提高肺通气和肺换气能力，增加血液中O2含量，减少CO2潴留，调节血液的酸碱平衡，从而干预COPD的发生发展。

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收稿日期:2015-04-12

R285．5

B

1006-3250(2016) 01-0066-07

2015-05-12

国家自然科学基金资助项目(81273889)

付小卫(1978-)，男，陕西咸阳人，副教授，医学博士，从事中医药痹症的临床与基础研究。

△通讯作者:鞠大宏(1963-)，男，辽宁凤城人，研究员，博士研究生导师，从事中医痹症的临床与基础研究，E-mail: judahong@sohu．com。