一种脱细胞真皮基质（A D M）制备方法的实验研究△

2016-04-05王志远王富生朱伟东深圳市龙岗区第二人民医院烧伤整形外科深圳518112

北方药学 2016年1期

王志远　王富生　朱伟东（深圳市龙岗区第二人民医院烧伤整形外科　深圳518112）

王志远王富生朱伟东（深圳市龙岗区第二人民医院烧伤整形外科深圳518112）

摘要：目的：优化实验条件，建立提取脱细胞真皮基质的可靠方法。方法：选择20例包皮环切术后切除包皮为研究材料，用胰蛋白酶的消化方式、高渗盐水分离皮肤表皮，用去垢剂法和胰蛋白酶去除真皮细胞成分，用组织病理学，抗原性和生物原性观察制备后细胞真皮基质进行鉴定。结果：20例同种异体真皮在组织学、抗原性及生物原性体征方面符合真皮基质的特性。结论：用酶消化法分离皮肤表皮，用酶消化法祛除真皮细胞成分，方法可靠，操作简单，制备脱细胞基质，符合真皮基质的特征，制成的真皮基质真皮基底膜完整，抗原性小，是理想的组织修复材料。

关键词：脱细胞真皮基质生物敷料组织修复同种异体真皮

大面积深度烧伤需进行皮肤移植修复创面，自体皮源缺乏是治疗大面积烧伤难点，故研究真皮替代物具有重要意义，脱细胞真皮基质（ADM）是近几年国外兴起的一种真皮替代物，是利用特定的方法将皮肤中的细胞成分去除，仅保留真皮中含胶原网架的细胞外基质。根据制备材料的来源分为同种异体真皮基质（Alloderm）与异种真皮基质（Xenoderm）两种。作为真皮替代物治疗全层皮肤缺损的效价在于它的低抗原性、快速血管化和作为表皮载体或支架的稳定性，这些特性很大程度上取决于ADM的最终成分。如今ADM的应用已远远超出作为单纯真皮替代物的范围，广泛应用于烧伤与整形科等领域。本课题为深圳市龙岗区科技局立项课题（YL2013164），着重研究酶消化法、高渗盐法、酶溶解法、去垢剂法进行ADM的实验室制备。

1　材料和方法

1.1一般资料：本实验所用20例整形外科切除废弃包皮组织，研究材料均来自本院整形外科门诊和住院病例，所取包皮组织为手术整形切除组织，标本取材前说明目的并征得同意，患者术前检查排除传染性疾病和慢性疾病。包皮组织均来自成年男性，年龄18～38岁，病程18～38年。

1.2标本处理：切取过长包皮组织放置在无菌袋中，4℃冰箱保存，术后环形远端包皮从一侧切口展开，形成平面，用剪刀修剪展开包皮，剪除残留皮下组织、毛囊等皮肤附属组织备用。

1.3制备过程

1.3.1表皮和真皮层分离的方法：采用酶消化和高渗盐水分离法分离表皮和真皮。酶消化法用的消化酶选择0.25%胰蛋白酶液200mL，放置实验包皮，置4℃冰箱24h，组织切片染色观察。高渗盐水分离法是将标本浸泡于1mmol/L氯化钠200mL溶液中，相同放置条件，利用高渗的原理，使锚着细丝与表皮基底细胞的半桥粒分离,从而完整地去除表皮，24h后组织染色切片观察。

1.3.2去除真皮中细胞成分的方法

1.3.2.1去垢剂法：去垢剂是一类可溶于水的脂类，它有亲水部分和疏水部分，能裂解脂膜，溶解抗原，清除免疫复合物。本课题选择十二烷基硫酸钠为去垢剂，其在溶液中的稳定性高，不易受强电解质如无机盐等的影响，能与生物膜中的磷脂等脂质结合形成复合物；同时十二烷基硫酸钠中的疏水端也能和膜蛋白结合破坏生物膜,从而使细胞溶解。该法脱除细胞彻底，但同时对基底膜结构破坏大不利于上皮细胞的黏附生长。

1.3.2.2生物酶法：采用胰蛋白酶作为脱细胞剂，本课题选择0.25%胰蛋白酶，在此基础上研究联合使用，观察是否能缩短制作脱细胞基质时间，是否更能促进真皮基质的无细胞化、保留更多的基底膜和降低抗原性。

1.4ADM的鉴定：在物理性质，组织学观察，抗原性和生物原性观测，制备ADM进行临床预实验，为今后临床应用打下基础。

2　结果

采用酶消化法及高渗盐水法分离表皮，用酶消化法和去垢法去除真皮细胞成分，我们共制备脱细胞真皮基质20例人同种异体脱细胞真皮基质，将所得脱细胞真皮基质组织病理学及抗原性检测结果如下：

表1　酶消化法及高渗盐水法分离表皮

表2　去垢法及酶消化法脱真皮中细胞成分

表3　郎罕氏细胞及细胞染色

3　讨论

皮肤移植是救治大面积烧伤、严重创伤的关键措施之一，虽然自体皮肤移植是覆盖全厚皮肤缺损创面的最好方法，但是，大面积烧伤患者的自体皮源常常不足，不得不寻求其他生物敷料，具有机械性和生理性保护作用的异体皮是目前较好的生物敷料，目前脱细胞真皮基质（allogenic acellular dermalmatrix，allo-ADM）及异种（猪）脱细胞真皮基质（xenogenic acellular dermal matrix，xeno-ADM）已在临床应用，但异体皮在移植后因机体的排斥反应不能长期存活。各种深度烧伤需修复创面，由于大面积烧伤自体皮源缺乏，造成治疗困难，研究真皮材料，对大面积烧伤救治，整形外科填充材料研究具有临床前景[1]。

皮肤由表皮和真皮组成，表皮为上皮组织，真皮为不规则的致密结缔组织。表皮由角化的复层鳞状上皮组成，分为角质层、透明层、颗粒层和生发层四层，其中生发层和角质层是表皮基本结构。除复层鳞状上皮（角质形成细胞）外表皮还有一类非角质形成细胞，它散在于角质形成细胞之间，如郎格罕斯细胞和黑色素细胞。真皮位于表皮深层，分为乳头层和网织层。乳头层内胶原纤维排列不规则，弹性纤维和网状纤维含量较少，各类结缔组织细胞较多，常见有成纤维细胞、肥大细胞、组织细胞和淋巴细胞等。网织层由粗大的胶原纤维组成，胶原纤维之间有较多的弹性纤维，即起到真皮支架的作用。皮肤基本结构中表皮和真皮结构中含有上述细胞成分与免疫密切相关，这些细胞表面表达高密度的MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子，它们是皮肤的APC，在皮肤移植排斥中发挥重要的作用，其中最重要的细胞为郎格罕斯细胞和角质细胞。实验表明，注射郎格罕斯细胞可明显加速皮肤移植物排斥和异体角质细胞注入真皮内可见明显的排斥反应。由于皮肤功能及再生能力有限，在大面积烧伤患者应用全层的猪皮或者尸体的全厚皮肤覆盖创面起到安全过渡休克期和急性感染期，但是由于移植皮肤内的细胞引起排斥反应，异体皮肤不能长期存活。所以设想从异种或异体真皮内除去诱导免疫排异的上皮细胞和内皮细胞成分,得到保持真皮原有结构、以真皮胶原为主体的低抗原性真皮替代物（DS），可减少或消除异种和异体真皮移植后的排异反应，达到上文所述的免疫耐受，以期移植物长期存活。这一设想首先由Wainwright，Livesey在异体无细胞真皮基质、动物实验和临床应用方面得到证实，作为网状自体刃厚皮片载体，获得较高的成活率，在短期覆盖创面方面起到很好的作用。国内烧伤界同行陈璧[2]，孙永华应用异体无细胞真皮基质结合超薄皮片在大面积烧伤患者，同样取得较高的生存率和比较满意的功能。虽然异体无细胞真皮基质移植取得较好的临床应用效果，但由于异体皮肤来源少，近年来,为进一步拓宽真皮替代物来源、摆脱异体皮肤存在的不足因素,人们再一次把目光转向无细胞异种真皮基质的研究应用。由于动物实验存在严重的炎症反应导致创面愈合不良，国外对xeno-ADM仍持有审慎的态度，但国内已过渡到临床应用上。通过反复冻融法，渗透溶液法，酶消化法和化学去污剂法等脱细胞法脱去异种真皮组织内含有大量抗原性较强的细胞成分,包括附件上皮细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、淋巴细胞、郎格汉斯细胞和成纤维细胞等。脱细胞后，真皮剩余的大部分为低抗原性非细胞成分，主要包括基质蛋白和胶原，但是仍会残留的免疫原性较强细胞膜抗原和基质蛋白，从而引起较强的免疫排斥反应[3]。

本课题研究从废弃包皮中制备脱细胞真皮基质，并在实验条件下探索制备方法，为进一步研究同种异体生物真皮替代物生物特性。从本课题用胰蛋白消化法、高渗盐溶液分离包皮表皮，实验发现酶消化法真皮分离完整，组织学观察，基底膜完整[4]，而高渗盐法表皮分离有表皮残留，基底膜基本完整，此观察与方林森等[5]，采用高渗盐-胰蛋白酶法制备脱细胞真皮基质研究结果相符，采用高渗盐-胰蛋白酶法制备脱细胞基质方法达到既能脱去表皮层细胞成分，又使基底膜完整连续，胶原弹力纤维结构及排列正常的双重目的，ADM柔韧性好、不断裂、无细菌生长。但分离表皮后，真皮中存在细胞成分，尤其是郎罕氏细胞，是发生排除反应主要成分，先期组织学电镜观察，发现标本中可见到细胞成分，需进一步处理，制备具有完全脱细胞成分真皮基质，用去垢剂法和酶消化法再次进行脱细胞处理，组织学电镜染色观察，两种方法均可以去除95%以上细胞成分，尤其是胰蛋白酶法不但能去除真皮成分，而且能保留真皮基底膜完整，去垢剂法去除细胞效果与胰蛋白酶法基本一致[6]，但观察发现基底膜完整性有差别。用去垢剂（十二烷基硫酸钠）、胰蛋白酶等去除真皮中细胞成分，能完全去除真皮细胞成分，不改变真皮中弹力纤维和胶原纤维的结构，制备工艺可操作性强，是一种简单有效的制备方法。