四氯化碳制备不同实验动物肝纤维化模型的研究

张迪，张全胜，张雅敏（.天津医科大学一中心临床学院，天津 009；.天津市第一中心医院器官移植实验室，天津 009；.天津市第一中心医院肝胆外科，天津 009）

由于各种理化因素或炎症长期反复作用于肝脏，引起肝细胞变性、坏死、增生和肝纤维结缔组织的增生和沉积[1]，称为肝纤维化。如未及时对其进行控制和治疗，严重者可发展为肝硬化、肝癌，严重威胁人类的健康与生活质量[2]。建立标准和理想的肝纤维化动物模型，模拟人类肝纤维化状态，对于研究肝纤维化的致病机制，筛选有效的抗纤维化药物，开展肝纤维化防治研究尤为重要。目前以四氯化碳（CCl4）法造模为多，本文主要介绍利用此方法在不同动物中建立肝纤维化模型。

1 动物选择

根据研究目的和检测手段的不同，可将实验动物分为小动物（大鼠、小鼠）和大动物（兔、狗等）。不同品系的小动物对CCl4的敏感性不同，因此，模型构建的结果也会有所差别。研究者在构建大鼠肝纤维化模型时常采用SD和Wistar品系大鼠，在构建小鼠肝纤维化模型时常用C57、BALB/c等品系小鼠。研究发现纯种BALB/c小鼠对CCl4的敏感性较高，纯种FVB/N小鼠对CCl4反应较差，而纯种C57小鼠对CCl4反应适中，常用来诱导中等程度的肝纤维化模型[3]。由于小鼠体型小，身体耐受性差，死亡率高，采集血液标本少，除特定药物研究和标本检测外，一般用大鼠进行小动物肝纤维化研究。对于大动物来说，具有外科操作简便，身体耐受性好，死亡率较低，可解决因动物模型体积小而不能进行某些实验研究（如肝性脑病磁共振波谱研究和肝移植的动物实验研究）的不足[4]。

2 致病机制

CCl4是诱导动物形成肝纤维化最常用的药物。CCl4进入机体后被肝细胞摄取而引起肝细胞损害。如果CCl4浓度过高，常引起急性中毒死亡。低浓度的CCl4进入机体15分钟后即可被肝细胞吸收引起肝细胞的中毒性损害，48小时后损害程度可达到高峰[5]。其主要机制为：CCl4被肝细胞吸收后，经细胞色素P450代谢产生CCl3自由基团[6]，导致肝细胞膜物质脂质过氧化，引起肝细胞膜物质的损害。影响内质网[7]、线粒体等亚细胞结构，使蛋白质合成受抑制，影响甘油三酯和蛋白质结合成脂蛋白的过程，引起肝内脂肪聚集，线粒体受损，致使能量产生减少，脂肪代谢障碍，从而加重肝细胞脂肪变性。长期给予CCl4可持续刺激成纤维细胞I型胶原基因大量表达，从而使I型胶原基因的合成增多，导致肝纤维化的形成[8]。

3 给药途径

CCl4诱导实验动物肝纤维化的成模时间可依给药途径和剂量而定。一般分为口服（灌胃）、腹腔注射和皮下注射3种方法[9-13]，也有研究人员采用CCl4蒸汽吸入法诱导小鼠肝纤维化的形成[3]。口服（灌胃）法由于肠道反应较大，动物不耐受，死亡率较高。腹腔注射法为比较常用的给药途径，但因腹腔注射会引起腹膜黏连，注射部位不准确会引起膀胱或肠道损伤，造成动物的死亡率也较高。相比之下，诸多研究表明，皮下注射可明显降低动物的死亡率，提高成模数量，但皮下注射一般需要熟练的手法技巧，切不可过深过浅，过深会导致进入肌肉，使CCl4的药物吸收浓度降低，过浅会引起皮肤溃烂或药物溢出。本研究在采用CCl4皮下注射法诱导小鼠肝纤维化时发现，即使注射部位精准，仍需每次更换刺入部位，否则同样会引起皮肤溃烂，不易成活。

4 造模方法

4.1 小鼠用药及剂量：30% CCl4橄榄油溶液或玉米油溶液，10μl/g，2次/周，共12周[14]。

饮食的控制：注射CCl4前4周，开始乙醇液体饲料喂养。乙醇液体饲料的热量构成比为：乙醇36%，蛋白质18%，脂肪35%，碳水化合物11%[15]。

4.2 大鼠用药及剂量：40% CCl4棉籽油或玉米油溶液，实验第1天皮下注射5 μl/g CCl4，以后每隔4天皮下注射3 μl/g CCl4，共注射10次。以单纯玉米面作为饲料，前2周为80%玉米面、20%猪油并混以0.5%胆固醇，以30%乙醇为饮料[16]。

有研究人员对上述饮食结构进行了改良，用50% CCl4棉籽油溶液以3 μl/g的量进行皮下注射，2次/周，普通颗粒饲料，以5%乙醇作为饮料，约8周后可获大鼠肝纤维化模型。

4.3 兔用药及剂量：纯CCl40.5 μl/g皮下注射，2 次 /周，约 12 周[17]。

饮食的控制：低蛋白，高脂肪膳食，配以10%乙醇作为饮料饮用。

4.4 狗用药及剂量：以0.12 μl/g剂量腹腔注射50%CCl4花生油溶液，2次/周，约8周[18]。

饮食的控制：米饭拌猪油，含猪油10%，配以10%乙醇作为饮料饮用。

本文所列以上方法为各研究者采用的最适方法。关于CCl4法构建各种类型动物肝纤维化模型的方法，各研究者采用不同的用药浓度、给药剂量、给药频次和给药周期，一般为20%～50% CCl4油溶液1～5 μl/g，2～3次/周，时间约为8～12周。虽然各研究方法不一，但最终均可成功建模。另外，配以低蛋白，高脂肪饮食，乙醇饮料作为饮食控制可增加各种动物对CCl4的敏感性，从而缩短建模周期[19]。

5 注意事项

5.1 动物称重与健康评估，呼吸频率改变、毛发粗糙、行为活动异常者不宜纳入造模范围[3]。

5.2 每次注射药物，应重新称量动物体重，以避免药物剂量过大引起中毒性死亡。随肝脏损害不断加重，动物体重会逐渐下降。

5.3 采用皮下注射时，针头深度须适宜，注射完毕后针头应在皮下停滞一会，避免药物渗出影响注射剂量，待下次注射时应更换注射部位，避免引起皮肤坏死。

5.4 采用灌胃时，须注意防止药物误入气管而使动物死亡。

5.5 采用腹腔注射时，应避免损伤膀胱及肠道，引起动物死亡。

5.6 注射药物期间，动物会出现食欲下降，体重减轻，行为异常，体质下降等现象，需注意饲养条件的清洁，以免引起感染。

5.7 配制药物时，操作者应注意防护措施，应在通风的房间里进行操作，以减少操作者对挥发性药物的吸入。

6 结 语

动物肝纤维化模型的建立对于临床肝纤维化疾病的防治研究具有重要意义。近年来，国内外采用多种方法诱导肝纤维化模型，主要包括化学中毒性肝纤维化（CCl4、二甲基硝铵[20]、D-半乳糖胺）、乙醇法[21]、免疫法、胆管阻塞法[22]等，但以CCl4诱导化学中毒建立肝纤维化模型居多。虽然方法不一，但病理发展过程一致，分为三期：肝细胞变性坏死期、纤维增生期和假小叶形成期。本研究采用40% CCl4玉米油溶液皮下法诱导小鼠肝纤维化模型时，前2周给予3 μl/g急性诱导肝细胞变性坏死，后期给予2 μl/g剂量维持，3次/周，普通饮食，6周左右病理可见成模。目前由于价格低廉、造模周期短，小动物肝纤维化模型较多，但肝脏体积小，血容量少限制某些检测手段，大动物模型的构建将成为以后研究肝纤维化疾病的趋势。