前泌通片对大鼠慢性非细菌性前列腺炎的治疗作用机制研究*

2016-04-04李广森常德贵张培海蔡剑董润标毕明帅俞旭君陈帝昂黄晓鹏尤耀东

中国男科学杂志 2016年6期

李广森常德贵, 张培海蔡剑董润标毕明帅俞旭君陈帝昂黄晓鹏尤耀东**

1. 成都中医药大学附属医院男科（四川成都 610072）；2. 成都中医药大学第二附属医院男科；3. 四川省中西医结合医院；4. 暨南大学医学院附属顺德妇儿医院；5.成都中医药大学

李广森1常德贵1,2张培海3蔡剑1董润标4毕明帅1俞旭君2陈帝昂1黄晓鹏5尤耀东5**

目的探究前泌通片对大鼠慢性非细菌性前列腺炎（chronic nonbacterial prostatitis, CNP）的治疗作用机制。方法60只SD大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、前泌通片低中高剂量组，每组10只。除空白组，余各组建立慢性前列腺炎模型。建模成功后，各组灌胃相应药物或生理盐水。免疫组织化学法检测前列腺组织NGF和TNF-α蛋白的表达以及PCR检测p38基因的表达。结果与模型组相比，前泌通片高、中剂量组NGF显著降低（P＜0.01），前泌通片高剂量组TNF-α显著降低（P＜0.01），前泌通片中剂量组有显著降低（P＜0.05），前泌通片高、中、低剂量组p38基因的表达有显著减小（P＜0.05）。结论前泌通片对慢性非细菌性前列腺炎的治疗作用可能与下调NGF和TNF-α蛋白以及p38基因有关。

前泌通片；前列腺炎；神经生长因子；肿瘤坏死因子α

慢性前列腺炎（ChronicProstatitis，CP）是男性常见和多发的疾病，约占泌尿门诊量的25%～30%［1］。其中慢性非细菌性前列腺炎（Chronic nonbacterial prostatitis，CNP）约占前列腺炎综合征的90%～95%，其病因和发病机制尚不明确［2］，属于祖国医学“精浊”、“劳淋”范畴，临床上以肝郁、气滞、血瘀、湿热等为主要病机［3］。前泌通片是经我科室多年临床经验总结，原名增瀑颗粒，由天台乌药散加减化裁而来，药物组成有天台乌药、延胡索、川楝子、木香、青皮、槟榔、泽兰、黄柏、川牛膝等，具有疏肝行气、活血止痛、清热利湿的作用，前期相关研究表明，前泌通片能有效改善慢性前列腺炎患者临床症状，对疼痛症状的改善尤为突出，能降低前列腺炎性细胞因子的分泌，改善前列腺功能［4］，同时还能通过调节Th1/Th2细胞平衡改善前列腺组织炎症［5］，由此可见，前泌通片对慢性前列腺炎具有良好疗效，其作用机制值得进一步深入研究。本研究通过建立慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型，采用S-P免疫组化法检测前列腺组织中NGF和TNF-α蛋白表达以及PCR检测p38基因表达，以期探讨前泌通片对慢性非细菌性前列腺炎的治疗作用机制，为该制剂从临床向新药转化奠定基础。

资料与方法

一、资料

（一）实验药物

前列通瘀胶囊生产单位：珠海星光制药有限公司，国药准字219990060。前泌通片生产单位：成都中医药大学附属医院，川药制字：Z20070658。

（二）实验动物

10周龄健康雄性、清洁级SD大鼠60只，体质量200～250g，由成都中医药大学动物实验中心（川实动管127号）提供，常规驯养1周后使用。

（三）仪器及试剂

RT-PCR扩增仪（PIKORed96，美国ThermoFisher仪器有限公司）、日本OLYMPUS生物显微镜、-80℃低温冰箱、低温离心机、恒温水浴锅、MicromHM 340E 石蜡切片机等。鼠抗人NGF（BA0766）、TNF-α（BA0798）单克隆抗体，均购自北京博奥森公司。p38和β-actin引物由北京博奥森公司合成。

二、方法

（一）实验分组

将60只雄性SD大鼠，正常喂养1周，随机分为6组：空白对照组（空白组）、CNP模型组（模型组）、CNP+前列通瘀胶囊组（阳性对照组）、CNP+前泌通片低剂量治疗组（低剂量组）、CNP+前泌通片中剂量治疗组（中剂量组）、CNP+前泌通片高剂量治疗组（高剂量组），每组l0只。

（二）实验造模

依据魏武然［6］建立的慢性非细菌性前列腺炎大鼠动物模型造模。具体方法是：模型组、对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠均用25%乌拉坦按1g/Kg量，经腹腔注射麻醉，无菌条件下做去势手术，术后放回鼠笼，密切观察。于术后第2日皮下注射苯甲酸雌二醇0.25mg/kg，每日一次，连续30d。空白组不做任何处理，正常喂养。

（三）给药方法

在最后一次皮下注射苯甲酸雌二醇后第二天，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别每天给予1.9g/kg、3.8g/kg、7.6g/kg （分别相当于推荐临床试验70kg成人日用剂量的5倍、l0倍、20倍）前泌通片灌胃；阳性对照组每天给予前列通瘀胶囊3.9g/kg（相当于临床试验70kg成人日用剂量的20倍）灌胃；空白组给予灌服0.9%的生理盐水。采用等容积不等浓度药液法给药0.1ml/10g体质量，连续用药4周。

（四）动物模型制备及标本采集

末次给药后24h，股动脉放血处死大鼠，剖取大鼠前列腺左叶迅速放置于10%福尔马林液固定，24h后作冠状面取材，石蜡包埋，以备切片用。另取部分组织与-80℃保存待测。

（五）检测指标及方法

1．前列腺组织NGF和TNF-α蛋白表达：采用S-P免疫组织化学法对前列腺组织NGF和TNF-α蛋白表达进行检查。

2．p38基因表达检测：Trizol法提取骨髓细胞总RNA。按试剂盒说明进行反转录和RT- PCR扩增。PCR反应体系为20 μL，扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃复性30s，共36个循环，最后72℃延伸7min。RT-PCR数据收集由Piko Real2.0软件完成，通过软件计算所有样品的Ct值，以β-actin作为内参照基因进行校准，采用2-△△Ct方法对p38基因表达进行相对定量：2-△△Ct表示通过参照基因校准的p38基因的相对表达水平。p38和β-actin引物信息见表1。

三、统计方法

表1 引物序列和长度

结果

一、一般状态观察

从大鼠灌胃的第一天开始，各组大鼠在造模过程中都不同程度的出现了摄食减少，精神萎靡等症状，3～5d后症状逐渐消失，一直到实验结束存活大鼠39只，其中空白组9只，模型组6只，阳性对照组6只，低剂量组6只，中剂量组6只，高剂量组6只；死亡21只，死亡原因可能是造模失败、造模手术术后感染、操作失误、灌胃方法操作不当及大鼠之间相互斗咬致死等。

二、前泌通片对大鼠前列腺组织NGF蛋白表达的影响

各实验组大鼠前列腺组织NGF免疫组织化学检测平均分光密度（MD）结果见表2。

由表2可知，与空白组比较，模型组大鼠前列腺组织NGF平均分光密度（MD）极显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，前泌通片高剂量组、前泌通片中剂量组大鼠前列腺组织NGF平均分光密度（MD）极显著降低（P＜0.01），前泌通片低剂量组大鼠前列腺组织NGF平均分光密度（MD）无明显变化（P＞0.05）。

三、大鼠前列腺组织TNF-α免疫组化检测结果

各实验组大鼠前列腺组织TNF-α免疫组织化学检测平均分光密度（MD）结果见表2。

由表2可知，与空白组比较，模型组大鼠前列腺组织TNF-α平均分光密度（MD）极显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，前泌通片高剂量组大鼠前列腺组织TNF-α平均分光密度（MD）极显著降低（P＜0.01），前泌通片中剂量组有显著降低（P＜0.05），前泌通片低剂量组有降低趋势，但差异无统计学意义。

四、前列腺组织细胞p38基因的表达

（一）RT-PCR溶解曲线分析

各实验组p38熔解曲线中有单一的主峰，P38 Tm值均为86.12℃，相同扩增条件下重复多次，得到的p38熔解温度上下浮动不超过1℃，融解曲线单一峰无非特异性荧光，说明产物特异性强，无引物二聚体，定量准确，见图1。

（二）p38 基因的2-△△CT值

各实验组大鼠前列腺组织p38 基因的2-△△CT值结果见表2。

由表2可知，与空白组比较，模型组大鼠前列腺组织p38基因的表达有显著增大（P＜0.05）。与模型组比较，前泌通片高、中、低剂量组大鼠前列腺组织p38基因的表达有显著减小（P＜0.05）。

表2 各组大鼠NGF和TNF-α蛋白的MD值和p38基因的表达比较（±s）

与模型组比较，*为P＜0.01，**为P＜0.05

NGF（MD）TNF-α（MD）p38基因（2-△△CT）空白组（n=9）0.0288±0.01020.0258±0.00680.1668±0.0452模型组（n=6）0.0735±0.01060.0885±0.01442.0260±0.5345阳性对照组（n=6）0.0350±0.00510.0216±0.00450.7629±0.1606前泌通片高剂量组（n=6）0.0385±0.00640.0383±0.01350.5033±0.1215中剂量组（n=6）0.0398±0.00900.0444±0.01100.6935±0.1357低剂量组（n=6）0.0775±0.01440.0753±0.02080.7165±0.2379

图1 p38 RT-PCR溶解曲线

讨论

慢性非细菌性前列腺炎占前列腺炎所有类型中的95%［7］。CNP的主要临床表现有：尿道刺激症状和膀胱会阴区疼痛。病因涉及病原体的入侵、尿液返流、前列腺液未能充分引流、神经性炎症等一个因素或者多个因素，它们单独或共同作用于前列腺组织导致前列腺周围敏感化和神经内分泌紊乱，最终导致大脑皮质中枢对盆腔神经调节失控并出现慢性神经病理性疼痛。其临床治愈率低，复发率高，影响患者的身心健康，降低患者的生活质量［8］。

目前医学水平还不能完全阐明CNP的发病机制，可能与尿液反流、会阴部长期钝性刺激、性生活不洁和过度摄入酒精等有关。其发病机制可能为：膀胱颈及其三角区的α受体被激动，平滑肌收缩，尿道阻力增加，造成排尿困难［9］。尿液反流可引起或加重前列腺的炎症，炎症促进周围组织释放前列腺素和致痛物质缓激肽，且前列腺素本身也是一种致痛物质，对缓激肽的致痛有协同作用。有研究报道［10］，慢性前列腺炎与患者免疫功能下降及前列腺慢性充血密切相关，由于炎症细胞浸润，腺体周围肌肉出现保护性痉挛，进而刺激神经，导致局部疼痛，前列腺的腺小管水肿或狭窄，前列腺液引流不畅，相应的腺泡被扩大，前列腺内压力增加，刺激低级神经中枢产生反射性疼痛；病变后期，前列腺腺体周围结缔组织增生或肌肉痉挛，均可压迫相应的神经，产生不适及疼痛。

对CNP机制的研究，既往的动物和临床观察实验已经从细胞功能水平上升到调节炎症反应应答机制水平。机体免疫异常是慢性非细菌性前列腺炎发病机制之一，其前列腺内的炎症反应可能是针对泌尿生殖道自身特定抗原的免疫反应引起的，即自身免疫过程［11］。其中神经生长因子NGF和促炎性细胞因子TNF-α的高表达，慢性非细菌性前列腺炎的发病中属于机体免疫应答异常。许多研究已证明Ⅲ型前列腺炎患者体内 TNF-α、IL-6 等促炎性细胞因子的过高表达，证实了 TNF-α 参与了前列腺炎症的形成。促炎性细胞因子通过各自的机制对前列腺组织造成损伤［12］。TNF-α可引起血管内皮细胞与白细胞黏附，有助于炎症局部聚集白细胞及活化炎性细胞杀伤微生物，并激活中性粒细胞和单核巨噬细胞，刺激它们合成 IL-1、IL-6、IL-8 等细胞因子，促进炎症反应［13］。而NGF在正常生理情况下属于神经营养因子，在炎症性反应中NGF浓度升高可引起疼痛加剧。在一些基础实验和对一些慢性疾病的研究中发现促炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α等）与NGF存在密切关联，促炎性细胞因子可促进NGF表达上升；同时NGF可反过来作用于促炎性细胞因子。Manni等［14］从新生的Wistar鼠中分离出含神经丛的肌肉层，培养出大量神经胶质细胞后，在TNF-α的刺激下，NGF及NGF受体（TrkA）的含量明显增加，TNF-α对NGF的促进作用呈时间和剂量依赖性，因此TNF-α作用于神经胶质细胞可引起NGF表达升高。

因此，NGF和TNF-α在慢性非细菌性前列腺炎的发生发展过程中起重要作用，两者之间存在密切联系和相互作用，在一些致病因素作用下， TNF-α增高，引起NGF表达上升，通过NGF直接或间接的作用于感觉神经纤维，从而产生疼痛症状，这可能是慢性非细菌性前列腺炎发病机制中的一个重要环节［15］。另一方面NGF可能反过来作用于促炎性细胞因子，对促炎性细胞因子产生抑制作用，从而抑制炎症反应。因此，NGF和TNF-α在前列腺组织中的表达量减少，可减轻前列腺的炎症反应。

p38 MAPK是细胞内信号转导途径的重要组成部分，可影响多种细胞因子的产生。研究发现p38 MAPK参与了炎症反应的调控，与多种炎性疾病有关，它的激活能促进中性粒细胞的活化及单核巨噬细胞产生TNF-α等炎性细胞因子［16］。对p38抑制剂的研究发现，它能有效地抑制前炎症细胞因子 TNF-α等的表达，在多种免疫炎性动物模型中能缓解炎症改变。另一方面，p38 MAPK能诱导脊髓星形胶质细胞活化，特别是L5～S2段脊髓星形胶质细胞的活化，导致CP的局限及泛化性疼痛［17］。因此，下调p38基因的表达能改善前列腺的炎性反应，改善其引起的疼痛症状。

中医学根据慢性非细菌性前列腺炎的临床症状体征将其归属于“淋证”、“精浊”等范畴。对本病的成因，《诸病源候论》云：“劳伤于肾，肾气虚冷故也。肾主水而开窍在阴，阴为溲便之道，胞冷肾损，故小便白而浊也”。《金匾要略》曰：“淋之为病，小便如粟状，小腹弦急，痛引脐中”。张介宾在《景岳全书》中提出：“有浊在精者，必由相火妄动，淫欲逆精，以致精离其位，不能闭藏，则源流相继，流溢而下，热移膀胱，则溺孔涩痛，精浊至，此皆白浊之因热也。及其久也，则有脾气下陷，土不制湿，而水道不清者，有相火已杀，心肾不交，精滑不固，而遗浊不止者”。其发病与患者纵欲伤肾、手淫过频、房事不节、阴虚体质、久居湿地、饮食不节、喜食辣食、过度嗜酒、久坐压迫局部有关，这些因素导致湿热下注、气血凝滞、正气亏累，继而伤及肾气。

随着对本病的研究不断深入，现代的大多数医家认为，气滞血瘀和湿热下注成为本病的主要原因。国内的一项关于此病的证型调查研究显示，气滞血瘀证、肝气郁结证和湿热下注证在临床患者中出现的频率最多［18］，并且此三证型大多相互夹杂合并出现，所以在治则上以理气活血、清热利湿通淋为主。

前泌通片正是以疏肝理气、活血化瘀、清热利湿为治法，其中天台乌药辛温，功专行气，治胸腹诸痛和尿频遗尿；延胡索辛苦温，活血行气止痛，善治气血瘀滞诸痛。二者配伍，共奏行气止痛、活血化瘀之功，共为君药。木香乃三焦气分之药，能升降诸气，青皮疏肝理气、消积化滞，槟榔行气利水，三药配合，助君药以行气止痛，共为臣药。泽兰活血祛瘀、利水消肿，助延胡索活血，兼以行水利湿；黄柏具有清热燥湿、泻火解毒作用，善治湿热下注之小便频数、淋沥涩痛，二药共为佐药。川牛膝活血通经、补肝肾、强筋骨、利水通淋、引火下行，善引诸药下行，以使药达病所，为使药。以上诸药合用，结合慢性非细菌性前列腺炎疾病发展的过程，具有疏肝行气、活血止痛、清热利湿的作用。

本研究证实，慢性前列腺炎大鼠的前列腺组织中NGF、TNF-α、p38基因的表达高于正常大鼠。与模型组比较，中、高剂量的前泌通片能有效降低慢性前列腺炎大鼠前列腺组织中NGF、TNF-α的表达，而低剂量组的变化则无统计学意义。另外，高、中、低剂量的前泌通片均能下调大鼠前列腺组织p38基因。前泌通片可显著下调慢性非细菌性前列腺炎大鼠前列腺组织p38基因、NGF及TNF-α蛋白的表达，从而改善前列腺组织炎症，为慢性非细菌性前列腺炎的治疗提供了新的理论和实验依据。

1 郭应禄, 李宏军. 主编. 前列腺炎. 第二版. 北京: 人民军医出版社, 2007: 120

2 梁朝朝. 慢性前列腺炎诊治的若干问题. 中国男科学杂志 2007；21（4）: 1-4

3 周青, 贺菊乔, 王大进, 等. 1083例慢性前列腺炎中医证型分布调查研究. 湖南中医药大学学报 2008；28（6）: 71-73

4 常德贵, 陈海, 张培海, 等. 增瀑颗粒治疗气滞血瘀型慢性前列腺炎的临床研究. 中国男科学杂志 2009；23（9）: 47-50

5 李广森, 常德贵, 张培海, 等. 前泌通片基于Th1/Th2细胞平衡对大鼠慢性非细菌性前列腺炎的作用机理研究.中国男科学杂志 2015；29（8）: 13-17

6 魏武然, 张唯力, 戴君勇. 大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型的建立. 中国男科学杂志 2006；20（1）: 22-24

7 米华, 陈凯, 莫曾南. 中国慢性前列腺炎的流行病学特征. 中华男科学杂志 2012；18（7）: 579-582

8 赵良运, 张宁南, 王文卫, 等. 慢性前列腺炎常见致病因素的回顾性分析（附4 062例报道）. 中国男科学杂志2015；29（9）: 33-36

9 谭丹, 张唯力, 张建华. 慢性前列腺炎病因学研究进展.中国男科学杂志 2008；22（6）: 61-63

10 周晓辉, 韩蕾, 周智恒, 等. 免疫性慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型的形态学与分子生物学特性. 中华男科学杂志 2005；11（4）: 290-295

11 Di Mola FF, Friess H, Zhu ZW,et al. Nerve growth factorand Trk high affinity receptor （TrkA） gene expression ininflammatory bowel disease.Gut2000；46（5）: 670-679

12 Miller LJ, Fischer KA, Goralnick SJ,et al. Nerve growth factor and chronic prostatitis/chronic pelvic painsyndrome.Urology2002；59（4）: 603-608

13 von Boyen GB, Steinkamp M, Reinshagen M,et al. Nerve Growth Factor Secretion in Cultured Enteric Glia Cells is Modulated by Proinf l ammatory Cytokines.Neuroendocrinol2006；18（11）: 820-825

14 Manni L, Aloe L. Role of IL-1 beta and TNF-alpha in theregulation of NGF in experimentally induced arthritis in mice.Rheumatol Int1998；18（3）: 97-102

15 黄宝星, 曹万里, 黄欣, 等. 大鼠慢性前列腺炎模型中TRPA1及相关炎症因子的表达. 中华男科学杂志 2015；21（1）: 23-30

16 Lee JC, Laydon JT, McDonnell PC,et al. A protein kinase involved in the regulation of inflammatory cytokine biosynthesis.Nature1994；372（6508）: 739-746

17 王强, 陈宇东, 刘艳如, 等. p38MAPK信号通路与前列腺炎疼痛关系研究进展. 白求恩医学杂志 2012；10（4）: 319-322

18 李兰群, 李海松, 郭军, 等. 慢性前列腺炎中医证型临床调查. 中华中医药杂志 2011；26（3）: 451-454

（2015-12-23收稿）

Theraputic effects of Qian Mi Tong on chronic non bacterial prostatitis in rats and its mechanism＊

Li Guangsen1, Chang Degui1,2, Zhang Peihai3, Cai Jian1, Dong Runbiao4, Bi Mingshuai1, Yu Xujun2,Chen Di'ang1, Huang Xiaopeng1, You Yaodong4**
1. The Department of Andrology, Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, China；2. By the Second Aff i liated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine；3. Sichuan Integrative Medicine Hospital；4. Shunde Maternal and Children Health Hospital Aff i liated to Jinan University；5.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

You Yaodong, E-mail:yyd110@163.com

Objective To investigate therapeutic effects ofQian Mi Tongon chronic non bacterial prostatitis in rats and explore its mechanism treated by.MethodsTotal of 60 SD rats were randomly divided into the control group, the model group, the positive group,Qian Mi Tonghigh /medium/low dose group, each group10 rats. Except rats in the blank group, rats in other groups were fi rst induced to be models of chronic nonbacterial prostatitis. The rats with chronic nonbacterial prostatitis in each group were intragastrically administrated with corresponding drugs or saline. The expressions of NGF and TNF-α protein in prostate tissue were detected by immunohistochemistry, and p38 gene expression were analyzed by PCR.ResultsCompared with that of the model group, NGF expression inQian Mi Tonghigh, middle dose group decreased signi fi cantly （P＜0.01）, and TNF-α expression in Qian Mi Tong high dosage group （P＜0.01） and inQian Mi Tongmiddle dose group also decreased signi fi cantly （P＜0.05）. p38 gene expressions inQian Mi Tonghigh, medium and low dose group all signi fi cantly decreased （P＜0.05）.ConclusionThe therapeutic effect of theQian Mi Tongon the non bacterial chronic prostatitis may be related to downregulation of NGF, TNF-α and p38 gene.

Qian Mi Tong；prostatitis；Nerve Growth Factor；Tumor Necrosis Factor-alpha

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.06.003

R697.33

资助：成都中医药大学附属医院科技基金项目（编号：2011-D-YY-22）

**通讯作者，E-mail:yyd110@163.com