卵母细胞和胚胎发育中的DNA双键断裂损伤

孙绪磊，冷义福，胡淑敏，张学奎，徐嘉君

（沈阳九州家圆医院，辽宁 沈阳 110000）

卵母细胞和胚胎发育中的DNA双键断裂损伤

孙绪磊，冷义福，胡淑敏，张学奎，徐嘉君

（沈阳九州家圆医院，辽宁 沈阳 110000）

在体细胞中，DNA双键断裂（DNA doubled-strand breaks，DSBs）是目前已知DNA损伤中最为严重的一种。进一步的研究发现，DSBs能够引起哺乳动物卵母细胞凋亡，导致生殖能力下降。针对DSBs后机体进行的DNA损伤应答通路的研究在生殖领域也成为热点。但是卵子发生和后期胚胎发育过程中，参与DSBs损伤修复机制的基因，是怎样突破染色体精确结构，最终完成DNA修复，维持基因组稳定或启动细胞凋亡过程的，这一复杂调控机制尚不十分明确，亟需进一步研究。

DSBs；DNA损伤修复；卵母细胞；胚胎发育

在体细胞中，DSBs是目前已知DNA损伤中最为严重的一种。DNA链断裂可以在正常的生理过程中发生，如DNA复制过程中的错配或异常的拓扑异构酶I和II活性；同时也可以由环境中的有害因素导致，如化学试剂，重金属，紫外光以及电离辐射[1]。许多化学电离辐射诱导的细胞凋亡是阻断DNA复制的结果，导致复制叉形成失败和DSB的发生。DSBs如果不及时准确的修复，可能会导致基因组大范围的畸变，从而使得细胞周期阻滞或细胞凋亡。

为了应对DSBs损伤，生命体进化DNA损伤应答（DNA-damage response，DDR）机制，DNA损伤修复基因可修复由不同原因导致的DNA损伤，防止错误遗传信息的传递，保护遗传信息的完整性。现在已知有两种机制参与DNA DSBs的修复。一种是同源重组（Homologous recombination，HR），也称为同源末端链接（homologous end-joining，HEJ）；一种是非同源性末端链接（nonhomologous end-joining，NHEJ）[2]。NHEJ在有丝分裂G1/G0期中起主要作用，而HR在减数分裂，有丝分裂晚期S/G2期以及胚胎细胞修复中发挥重要作用。DSBs由包括信号（激酶）或修复活性的蛋白识别。其中最重要的成员是是共济失调毛细血管扩张症突变基因（ATM）和同源的ATR蛋白，两者皆由DSBs激活[3]。一旦被激活，ATM通过Mre11-Nbs1-Rad50复合体被募集到DNA双链断裂处，ATM磷酸化并激活细胞凋亡、细胞周期停滞以及DNA修复等的多个下游效应分子。ATM和ATR有三个重要功能：调节和刺激DSB修复，细胞周期信号调控以及通过p53调控细胞凋亡[4]。

以前对于DSBs损伤修复通路研究最多最广泛的是癌症医学的靶向治疗方面。最初的研究发现，患癌后经过化疗幸存的年轻女性，其卵巢储备功能显著下降，许多患者癌症化疗后生育能力显著下降或丧失，提示化疗药物可能损伤卵巢功能和卵子质量[5]。进一步人的卵巢组织体外培养和小鼠体内实验发现，化疗药物能够对人和啮齿类动物初级卵泡，卵母细胞以及颗粒细胞以剂量依赖的方式造成大量的DNA双键断裂损伤，而且这一损伤与卵母细胞凋亡以及ATM的激活有关[6]。不同的是，啮齿类动物卵母细胞有通过基因毒性应激修复DSBs的能力[7]。乳腺癌敏感基因1即BRCA1（breast cancer susceptibility gene1）是ATM介导的DSBs修复基因家族中的关键成员。BRCA基因的突变，是乳腺癌、卵巢癌和其他癌症发生的高危因素。随后的研究发现，BRCA1突变的女性在控制性超数排卵时，往往伴随卵巢低反应的发生，并且有卵巢早衰现象[8-9]。这些发现说明，DNA DSBs的修复能力对于卵巢储备和卵子凋亡都有十分密切的关系。

根据哺乳动物物种的不同，卵母细胞停滞在生发泡期（germinal vesicle，GV）长达几个月甚至几十年之久，直至它们恢复第一次减数分裂。这一长时间的静止期，使得卵母细胞染色质能够遭受各种体内外因素影响，从而导致DNA发生DSBs，影响卵母细胞发育潜能和雌性生殖力。雌性的生殖力随着年龄的增加是逐步下降，直至丧失的。随着年龄的增加，雌性哺乳动物的卵巢储备功能而降低，卵母细胞损失的比率明显增高。而所有的细胞，包括卵母细胞和颗粒细胞，其DNA损伤都是随着年龄的增加而加剧的。

γH2AX是研究DNA DSBs的标志基因。DNA双键断裂后，组蛋白H2AX在DNA双键断裂处迅速磷酸化形成γH2AX焦点（γH2AX foci），它的表达量可以衡量DSBs发生的程度。有研究发现，老龄猕猴卵泡中颗粒细胞上γH2AX表达量相较于年轻猕猴显著增加，但是BRCA1在卵子和颗粒细胞中的表达却是降低的[10]。人和啮齿类动物相应的研究发现，卵母细胞中DNA DSBs随着年龄的增长而增加，与此形成对应的是一些DSBs修复基因（如BRCA1）在卵母细胞中表达降低[11]。这说明，卵母细胞中增加的DSBs与年龄引起的DNA损伤修复水平降低有关。但是在牛上的研究结果显示，IVM过程中DNA修复基因RAD51，APEX-1和 MLH1的表达量升高，但是只有RAD51的表达在年轻和老龄的供体牛中有差异[12]。

IVM和IVP过程中，有些研究运用了许多方法制造DNA双键断裂，如激光显微切割和药物处理，从而揭示DSBs对于卵母细胞减数分裂进程以及后期胚胎发育的影响。博莱霉素（Bleomycin，BLM）或激光显微切割处理小鼠卵母细胞，能够降低GVBD的发生，并延长GVBD的时间。第一极体的排出也受到延迟，但是一旦GVBD发生，第一极体排出并不受影响[13]。这些经过DSBs损伤最终成熟的小鼠的卵母细胞能够被孤雌激活，但是胞质内会形成多核或多微核。这说明在小鼠上DSBs抑制或延迟G2/M转变，但是一旦GVBD发生，DNA损伤的卵母细胞可以完成染色体分离和第一极体排出，此时纺锤体组装检验点（SAC）活性很高，导致卵母细胞内形成多微核。进一步小鼠的体内外对比实验发现，体外DSBs导致小鼠卵母细胞体外成熟过程中纺锤丝检测点的激活，并且影响纺锤体微管着丝粒连接中断。尽管体外培养过程中发生了严重的DSBs，还是会有卵母细胞能够成熟。但是腹腔注射BLM后对小鼠进行超排，获卵数显著降低，且卵子凋亡比例显著升高[14]。激光处理小鼠合子中的雄原核或雌原核，胚胎发育能力显著降低，这些合子最终形成不了囊胚。激光处理部分卵裂球最终发生凋亡，而未处理的卵裂球则继续发育形成囊胚，但是囊胚形成率和细胞数显著降低[15]。BLM处理猪的卵母细胞，DSBs的发生呈剂量依赖性，但并不影响GVBD，却阻碍卵母细胞的最终成熟，表现为第一极体不排出[16]。

体外胚胎发育过程中，DSBs修复机制的研究意义是巨大的。尽管胚胎发生DSBs后会影响发育，但是与体细胞相比，胚胎的DSBs修复机制和能力是不同的。有研究发现，猪的孤雌胚胎中，早卵裂的胚胎DSBs较少，DSBs修复基因表达水平较低。早卵裂和晚卵裂的胚胎DSBs水平，在囊胚期无差异，这表明只有较少DNA损伤或者有超强DNA修复能力的胚胎才会发育至囊胚[17]。由于与人在卵泡波出现，卵泡选择，排卵以及和年龄相关的内分泌变化方面都特别相近，牛已被公认作为一个合适的动物模型研究生殖力保存。在牛上，体外受精胚胎合子期γH2AX的表达量显著高于孤雌胚胎和体细胞核移植胚胎。但在随后的发育阶段，γH2AX的表达量各组相当[18]。此外，该研究中γH2AX表达量在体外培养的牛的胚胎中从1cell期到囊胚期是减少的，这说明在牛体外胚胎发育过程中DNA修复机制发生作用，但是这一机制是怎样参与调控的目前尚无报道。

尽管DSBs影响卵子质量与胚胎发育的研究已有报道，但是只是针对某一修复通路里的某几个关键基因的表达。在配子发生和胚胎发育过程中，DSBs引起的DNA修复应答机制和关键通路的系统研究报道较少。综上研究显示，DSBs对不同物种卵母细胞、颗粒细胞和胚胎发育的影响是有差异的，对同一物种体内外成熟的卵母细胞的影响也是有差异的，甚至胚胎发育进程不同的胚胎影响也有差异。这些影响与DNA修复水平密切相关，但是又存在许多差异，需要系统的研究。

在不同的外源因素和内源生理状况下，卵子发生和后期胚胎发育过程中，参与DSBs损伤修复机制的基因，是怎样突破染色体精确结构，最终完成DNA修复，维持基因组稳定或启动细胞凋亡过程的，这一复杂调控机制尚不十分明确，亟需进一步研究。

[1] Roos, W.P., Kaina, B. DNA damage-induced cell death by apoptosis. Trends Mol. Med,2006,12:440-450.

[2] Liu T., Huang J.DNA End Resection: Facts and Mechanisms. Genomics Proteomics Bioinformatics,2016,14(3):126-130.

[3] Cooper TJ,Wardell K,Garcia V,Neale MJ. Homeostatic regulation of meiotic DSB formation by ATM/ATR. Exp Cell Res,2014,329(1):124-131.

[4] Lavin, M.F. et al. ATM signaling and genomic stability in response to DNA damage. Mutat,2005,569:123–132.

[5] Wenzel L, Dogan-Ates A, Habbal R, Berkowitz R, Goldstein DP, et al. Def i ning and measuring reproductive concerns of female cancer survivors. J Natl Cancer Inst Monogr,2005,34:94-98.

[6] Reza Soleimani, Elke Heytens, Zbigniew Darzynkiewicz, Kutluk Oktay. Mechanisms of chemotherapy-induced human ovarian aging: double strand DNA breaks and microvascular compromise. AGING,2011,3:782-793.

[7] L. L. Kujjo, T. Laine, R. J. Pereira, W. Kagawa, H. Kurumizaka, S. Yokoyama, G. I. Perez.Enhancing survival of mouse oocytes following chemotherapy or aging by targeting Bax and Rad51. PLoS One,2010,5:9204.

[8] K. Oktay, J. Y. Kim, D. Barad, S. N. Babayev. Association of BRCA1 mutations with occult primary ovarian insufficiency: A possible explanation for the link between infertility and breast/ ovarian cancer risks. J. Clin. Oncol,2010,28:240–244.

[9] Oktay K1, Moy F, Titus S et al. Age-related decline in DNA repair function explains diminished ovarian reserve, earlier menopause, and possible oocyte vulnerability to chemotherapy in women with BRCA mutations. J Clin Oncol,2014,32(10):1093-1094.

[10] Dongdong Zhang,Xiaoqian Zhang, Ming Zeng, Jihong Yuan, Mengyuan Liu et al. Increased DNA damage and repair def i ciency in granulosa cells are associated with ovarian aging in rhesus monkey. J Assist Reprod Genet,2015,32(7):1069-1078.

[11] Shiny Titus, Fang Li, Robert Stobezki, Komala Akula, Evrim Unsal et al. Impairment of BRCA1-Related DNA Double-Strand Break Repair Leads to Ovarian Aging in Mice and Humans. Sci Transl Med, 2013,5(172):172,21.

[12] S. Bilotto, R. Boni, G.L. Russo, M.B. Lioi. Meiosis progression and donor age affect expression prof i le of DNA repair genes in bovine oocyte. Zygote ,2013,23:11–18.

[13] Jun Yu Ma, Ying Chun ou Yang, Zhong Wei Wang, Zhen Bo Wang, Zong Zhe Jiang et al.The effects of DNA double-strand breaks on mouse oocyte meiotic maturation. Cell Cycle,2013,12(8):1233–1241.

[14] Fei Lin, Xue Shan Ma, Zhen Bo Wang, Zhong Wei Wang, Yi Bo Luo et al. Different fates of oocytes with DNA double-strand breaks in vitro and in vivo. Cell Cycle,2014,13(17):2674-2680.

[15] Zhong Wei Wang, Xue Shan Ma, Jun Yu Ma, Yi Bo Luo, Fei Lin et al. Laser microbeam-induced DNA damage inhibits cell division in fertilized eggs and early embryo. Cell Cycle,2013;12(20): 3336–3344.

[16] Zhang T, Zhang GL, Ma JY, Qi ST, Wang ZB et al. Effects of DNA damage and short-term spindle disruption on oocyte meiotic maturation. Histochem Cell Biol, 2014,142(2):185-94.

[17] Rodrigo Camponogara Bohrer, Ana Rita S. Coutinho, Raj Duggavathi, and Vilceu Bordignon. The Incidence of DNA Double-Strand Breaks Is Higher in Late-Cleaving and Less Developmentally Competent Porcine Embryo. Biol Reprod,2015,93(3): 1–8.

[18] A.F. Pereira, L.M. Melo, V.J.F. Freitas, D.F. Salamone1. Phosphorylated H2AX in parthenogenetically activated, in vitro fertilized and cloned bovine embryos. Zygote,2014,23:485-493.

本文编辑：徐 陌

R698.2

B

ISSN.2095-8803.2016.20.194.02